定稿第五章紫外-可见分光光度法

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(完整版)紫外—可见分光光度法教案

第五章紫外—可见分光光度法一．教学内容1．紫外－可见吸收光谱的产生（分子的能级及光谱、有机物及无机物电子能级跃迁的类型和特点）2．吸收定律及其发射偏差的原因3．仪器类型、各部件的结构、性能以及仪器的校正4．分析条件的选择5．应用（定性及结构分析、定量分析的各种方法、物理化学常数的测定及其它方面的应用二．重点与难点1．比较有机化合物和无机化合物各种电子跃迁类型所产生吸收带的特点及应用价值2．进行化合物的定性分析、结构判断3．定量分析的新技术（双波长法、导数光谱法、动力学分析法）4．物理化学常数的测定三．教学要求1．较为系统、深入地掌握各种电子跃迁所产生的吸收带及其特征、应用2．熟练掌握吸收定律的应用及测量条件的选择3．较为熟练仪器的类型、各组件的工作原理4．运用各种类型光谱及的经验规则，判断不同的化合物5．掌握定量分析及测定物理化学常数的常见基本方法6．一般掌握某些新的分析技术四．学时安排5学时研究物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱的分析方法称为紫外-可见分光光度法。

紫外—可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收200 ~ 800 nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。

这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。

第一节紫外—可见吸收光谱一、分子吸收光谱的产生在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。

这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。

在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。

若用△E电子、△E振动、△E转动分别表示电子能级、振动能级转动能级差，即有△E电子>△E振动>△E转动。

处在同一电子能级的分子，可能因其振动能量不同，而处在不同的振动能级上。

当分子处在同一电子能级和同一振动能级时，它的能量还会因转动能量不同，而处在不同的转动能级上。

所以分子的总能量可以认为是这三种能量的总和：E分子=E电子+ E振动+ E转动当用频率为ν的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差△E恰好等于该电磁波的能量hν时，即有△E= hν（h为普朗克常数）此时，在微观上出现分子由较低的能级跃迁到较高的能级；在宏观上则透射光的强度变小。

紫外-可见分光光度法

30.01mg→100ml 5→50ml 浓度为30.01ug/ml
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190～900nm。
第二节光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律：比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的理论基础。 Lambert于1730年提出了光强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都有各自的空心阴极灯，因此原子吸收光谱是锐线光谱。

紫外可见分光光度法解析课件

即 T= It/I0
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律当一束平行单色光通过含有吸光物质的
稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
2. 使用仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校正）；5. Data display（光度直接测量模式）。根据需要测量的实验项目按相
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。
A lg 1 lg I0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度（g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称为比吸光系数。它们的关系如下：
4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。
4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。

第五章紫外可见分光光度法

二、分光光度计的类型
1.单光束
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
2.双光束
自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ1、λ2) 快束交替通过同
⑤出射狭缝。
3. 样品室
样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。
4. 检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理
一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。
△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
请选择内容：
第一节基本原理第二节紫外-可见分光光度计第三节显色与测量条件的选择第四节分光光度测定方法第五节有机合物紫外光谱解析
结束
第五章紫外可见分光光度法
仪器
可见分光光度计
2.单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；

紫外-可见分光光度法 PPT课件

若化合物在某波长处有强的吸收峰，而所含杂质在该波长处无吸收或吸收很弱，则化合物的吸光系数将降低，若杂质在
该波长有比此化合物更强的吸收，将会使化合物的吸光系数
增大，且会使化合物的吸收光谱变形。（举一个间接的例子
吧，前一段时间快检车抽到一批吗叮啉，红外快检认定是假
药，送到所里以后，我们用薄层法做了一下，发现样品也显
百分吸收系数 377
吸收度值 277nm 0.461

0.461×0.2609×100.00×200.00
含量=-----------------------------------×100%=96.97%

377×0.0658×5.00×0.2×100
二、多组分定量测定解线性方程组法等吸收双波长消去法系数倍率法导数光谱法
面神经麻痹的病理变化早期主要为面神经水肿髓鞘和轴突有不同程度的变性以在茎乳突孔和面神经管内的部分尤为显著w五测定时除另有规定外应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照测定吸光度实际上是透光率而在测定光强弱时不只是由于被测物质的吸收所致还有溶剂和容器的吸收光的色散和界面反射等因素都可使透射光减弱用空白对照可排除这些因素的干扰
由上图可以看出吸收光谱的特征： ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。 ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表示。 ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，形状像肩的部位，称肩峰，以λsh表示。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
利用物质的吸收光谱进行定量、定性及结构分析的方法称为吸收光谱分析法。紫外－可见吸收光谱是一种分子吸收光谱，它是由于分子中原子的外层电子跃迁而产生的。

仪器分析-第五章-紫外-可见分光光度法精选全文完整版

远紫外区：200 - 400 nm 可见光区：400-750 nm
2. 物质对光的选择性吸收及吸收曲线
M + h M*
M +热
基态
激发态
M + 荧光或磷光
E1 （△E） E2
E = E2 - E1 = h ：量子化；选择性吸收吸收曲线与最大吸收波长 max
用不同波长的单色光照射，测吸光度
光的互补：蓝➢ 黄
助色团：
有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR
、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有
生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π
共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加) ，这样的基团称为助色团。
红移与蓝移
有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收
羰基化合物含有C=O基团。 C=O基团主要可产生*、 n* 、n*三个吸收带， n*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异，因此它们n*吸收带的光区稍有不同。
羧酸及羧酸的衍生物虽然也有n*吸收带，但是，羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于这些助色团上的n电子与羰基双键的电子产生 n共轭，导致*轨道的能级有所提高，但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级，因此实现n* 跃迁所需的能量变大，使 n*吸收带蓝移至210nm左右。
⑴配位体微扰的金属离子d一d电子跃迁和ｆ一ｆ电子跃迁
摩尔吸收系数ε很小，对定量分析意义
不大。

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紫外-可见分光光度法1 简述紫外-可见分光光度法是在190-800nm 波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和含量测定的方法。

定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。

物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。

有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外区（200~400nm ）或可见光区（400~850nm ）产生吸收。

通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190~900nm 。

紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。

朗伯-比尔（Lambert-Beer ）定律为光的吸收定律，它是紫外-可见分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为: A=logT1=ECL 式中 A 为吸光度;T 为透光率;E 为吸收系数;C 为溶液浓度;L 为光路长度。

如溶液的浓度（C ）为1%（g/ml ），光路长度（L ）为lcm ，相应的吸光度即为吸收系数以%11cm E 表示。

如溶液的浓度（C ）为摩尔浓度（mol/L ），光路长度为lcm 时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。

2 仪器紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。

为了满足紫外-可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。

单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件，聚焦透镜或反射镜等组成。

色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200~40Onm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。

紫外-可见分光光度法课件

应用：多组分测定
A 总 A aA bA c
14
比尔定律在有化学因素影响时不成立。解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对
比尔定律产生偏离。比尔定律在有仪器因素影响时也不成立。非单色光对比尔定律产生偏离。杂散光(非吸收光)也会对比尔定律产生影
响。其他影响因素包括溶剂、光效应等也应考
虑。
15
E
Eh (dg) = 0.6 o
dz2
dx2-y2
(dg)
o 0.6 o
E=0
0.4 o
El (d) = - 0.4 o dxz
(d)
dyz dxy
d～d跃迁：吸收了光后，d电子可从能量低的d轨道向能量高的d轨道跃迁，其能量差一般在120～360kJ·mo1-1 它包括全部可见光范围。
49
配合物的颜色分裂能不同，产生d～d跃迁所需的能量就
10
11
不同浓度时三(邻二氮菲)合铁(II)配离子的吸收光谱示意图
12
二、 Lambert-Beer 定律
当一束平行单色光通过均匀溶液时，溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比图4.14
I0＝Ia+It
Ia
T＝It/I0 AlgT
lgI0
I0
It
It
Lambert定律，A=k1b
Ir
b
Beer定律，A=k2 c
朗伯－比尔定律：A＝kbc A = ε bc
ε ：摩尔吸光系数，单位为L·mol-1·cm-1。
13
Lamber-Beer定律的适用条件
入射光为单色平行光。均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂
及悬浊物引起的散射该定律适用于固体、液体和气体样品在同一波长下，各组分吸光度具有加和性

紫外可见分光光度法

案例导入
在夏天参加户外活动时，假如天气晴朗，就应该注意保护皮肤，不然，暴露在火辣辣太阳之下旳皮肤，数小时后就会出现红肿、瘙痒、发烧、刺痛症状，数后来出现蜕皮现象，这表白太阳光中有一种光线能伤害生物细胞。科学家研究证明，这种光线是紫外线。
根据可见光、紫外光与物质分子旳相互作用建立了紫外-可见分光光度法，
仪器简朴
操作简便
价格低廉
测定迅速
第一节概述
课堂活动
1．紫外-可见光旳波长范围是
A．200~400nm
B．400~760nm
C．200~760nm
D．360~800nm
2．下列论述错误旳是
A．光旳能量与其波长成反比
B．有色溶液越浓，对光旳吸收也越强烈
C．物质对光旳吸收有选择性 D．光旳能量与其频率成反比
第一节概述
一、物质对光旳选择性吸收
单色光: 单一波长旳光束复合光: 具有多种波长旳光束电磁波谱: 以波长大小顺序排列旳电磁波谱图
波长 10pm 300pm 200nm 400nm 800nm 500mm 1cm 1m
光谱射线 X射线紫外光可见光红外光微波无线电波
措施光谱法
分光光度法光谱法
第三节紫外-可见分光光度计
二、紫外-可见分光光度计旳光学性能
1．测光方式 3．狭缝或光谱带宽 5．波长精确度 7．波长反复性 9．光度反复性
2．波长范围 4．杂散光 6．吸光度范围 8．测光精确度 10．辨别率
第三节紫外-可见分光光度计
三、紫外-可见分光光度计旳类型 1.可见分光光度计 721型
0.7范围内。若吸光度读数不在此范围，可采用哪些措施进行调整?
第四节分析条件旳选择

紫外-可见吸收光谱法精选全文完整版

溶剂极性增大
吸收峰呈规律性蓝移
3、溶剂效应
O
异丙叉丙酮（CH3-C-CH=C
CH3
CH3 ）的溶剂效应
吸收带
p → p*
正己烷
230nm
CH3Cl
238nm
CH3OH
237nm
H2 O
243nm
波长
红移
n→ p*
329nm
315nm
309nm

电子跃迁类型主要有四种：σ→σ*、n→σ*、π→π*和
n→π*，各种跃迁所需的能量大小不同，次序为：
σ→σ*> n→σ*≥ π→π* > n →π*，
因此，形成的吸收光谱谱带的位置也不相同。

σ→σ*跃迁：
需要能量最大， λ<200nm ，真空紫外区，εmax ＞ 104
饱和烃（远紫外区）；
C－H共价键，如CH4（ λmax 125nm）
(I) 顺式二苯乙烯 (II)反式二苯乙烯
2、跨环效应的影响
助色基团虽不共轭，但由于空间排列使电子
云相互影响，使 n→π*吸收峰长移。
O
CH3－C － CH3
O
C
S
lmax156，279 nm
lmax238nm
3、溶剂效应影响
溶剂的极性增大时，n p* 跃迁吸收带蓝移
p p* 跃迁吸收带红移
少，分析速度快。
2 灵敏度高。如在紫外区直接检测抗坏血酸时，其最低检出浓度可
达到10-6g/mL。
3 选择性好。通过适当的选择测量条件，一般可在多种组分共存的
体系中，对某一物质进行测定。
4 精密度和准确度较高。在仪器设备和其他测量条件较好的情况下，

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第五章紫外-可见分光光度法
(Ultraviolet and Visible Spectrophotometry, UV-Vis)
5.1 光谱分析概论 5.2 紫外-可见吸收光谱 5.3 光吸收定律 5.4 紫外-可见分光光度计 5.5 紫外-可见分光光度分析的实验条件 5.6 紫外-可见分光光度分析的应用 5.7 荧光光谱分析法简介
方法特点和应用：灵敏度高（检测下限可达10-4 -10-6 mol·L-1）。准确度高（相对误差2%～5%）。稳定性好。仪器设备相对较为简单、易于普及。用于无机、有机及生化物质的微量组份定量分析。测定配合物组成及稳定常数、弱酸解离常数、化学反应速率常数、催化反应活化能等。根据分子的紫外光谱判断有机化合物分子的空间构型，确定分子结构。
2.按产生光谱的微观粒子类别
原子光谱: 物质的原子（离子）与光辐射作用，或原子（离子）受能量激发后由电子能级跃迁所产生的光谱称为原子光谱,光谱的形貌特征是一组狭窄谱线间隔排列的线状光谱。可分为：原子发射光谱（atomic emission spectrum）原子吸收光谱（atomic absorption spectrum）原子荧光光谱（atomic fluorescence spectrum）
分子振动
2.5～50 μm
0.50～2.5×10-2
分子振动
50～1000 μm 2.5×10-2～1.2×10-3 分子转动
1～300 mm 1.2×10-3～4.1×10-6 分子转动
> 300 mm
< 4.1×10-6
电子和核自旋
5.1.2 物质光谱的分类
1. 按光辐射与物质相互作用吸收光谱（absorption spectrum）
分子光谱
主要用途
无机元素定性、定量金属元素定量无机元素定量无机元素定性、定量无机和有机物定性、定量无机和有机物定性、定量无机和有机物定量无机和有机物定性、定量有机物结构、定量有机物结构
5.2 紫外-可见吸收光谱
发展简史：目视比色法：用比色管通过肉眼比较颜色深浅估测物质浓度（源于18世纪）。光电比色法：用光电比色计（由光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计构成）定量测定物质浓度（20世纪 40年代前）。紫外-可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry, UV-Vis）又称紫外-可见吸收光谱法（ultraviolet and visible absorption spectrometry）：用紫外-可见分光光度计对物质定性及定量分析（20世纪40 年代后至今)。
用200～780 nm的紫外、可见光照射分子，在分子的电子能级发生跃迁的同时，伴随分子的振动和转动能级跃迁，产生分子的紫外-可见吸收光谱。
红外吸收光谱（infrared absorption spectrum）：用0.75～50 m的红外光照射分子，在使分子的振动能级发生跃迁的同时，伴随分子振动能级的跃迁，产生分子的红外吸收光谱。
5.1 光谱分析概论
5.1.1 电磁波谱和物质的能级跃迁
1.光的本质: 电磁辐射，具有波动及粒子的双重属性。波动性：表现为光在传播中的折射、衍射、干涉等现象。粒子性：表现为光压效应和光电效应等。
2.光能量与光频率(波长)的关系-普朗克（Planck）定律:
E h h c
E-光能量(J或eV, 1J=6.241×1018eV ) ν-光频率（Hz）, λ-光波长（m） c-光速(真空中为2.998×108 m∙s-1 ) h-普朗克常数（6.626×10-34 J∙s）。
波长 < 0.005 nm
能量/eV > 2.5×105
能级跃迁类型核能级
0.005～10 nm 2.5×105～1.2×102
内层电子
10～200 nm
1.2×102～6.2
内层电子
200～400 nm
6.2～3.1
外层电子
400～750 nm
3.1～1.6
外层电子
0.75～2.5 μm
1.6～0.50
5.1.3 光谱分析法的分类常按照与光辐射作用的物质微观粒子，结合产生的光
谱类型进行分类，一些常见的光谱分析方法如下表：
分析方法原子发射光谱法原子吸收光谱法原子荧光光谱法Ｘ－射线荧光光谱法荧光光谱法磷光光谱法化学发光分析法紫外-可见吸收光谱法红外吸收光谱法拉曼散射光谱法
光谱类型原子光谱
分子光谱: 物质分子与光辐射作用
或分子受激发后，由分子的价电子能级、分子内原子间振动能级、分子整体转动能级跃迁所产生的光谱称为分子光谱，光谱形貌表现为带状光谱。
右图为分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图。
紫外-可见吸收光谱（ultraviolet and visible absorption spectrum）：
3.电磁波谱
按波长或频率大小顺序排列的电磁辐射称为电磁波谱。物质与电磁辐射相互作用发生核能级、电子能级、分子振动和转动
能级、电子和核自旋能级等多种类型的能级跃迁。
仪器分析中应用最多的是光学光谱区（紫外光区、可见光区、红外光区）。红外光区中红外光区远红外光区微波区无线电波区
光辐射与物质作用，光辐射能量恰好等于物质粒子运动两个量子化能级间能量差，物质选择性吸收光辐射而产生吸收光谱。发射光谱（emission spectrum）物质被热、光、化学能等能量激发跃迁成为不稳定的激发态原子或分子，再由激发态能级跃迁到低能级，多余能量以光辐射的形式释放而产生发射光谱。
散射光谱
光辐射到物质分子上会发生光散射，散射光中除含有与入射光波长相同的成分，还有不同于入射光波长的新波长成分。包括：瑞利散射光谱（Rayleigh scattering spectrum）由与入射光波长相同的散射光形成，此散射不引起分子内能变化。拉曼散射光谱（Raman scattering spectrum）由对称分布在入射光波长两侧的长、短波长的散射光形成，是因入射光与分子相互作用，使分子的转动能级及振动能级发生变化，导致散射光的波长改变，这种改变随不同的分子结构而异。