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食管癌相关基因新作用伙伴p53的鉴定

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・７００・　

・基础研究・　山西医药杂志２００８年８月第３７卷第８期Ｓｈａｎｘｉ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ　２００８，Ｖｏｌ　３７，Ｎｏ．８　

食管癌相关基因新作用伙伴ｐ５３的鉴定　

山西医科大学炙　３　主　薹宋省静　

中国医学科学院肿瘤研究所　陆士新　中心体复制、纺锤体检测点是染色体稳定性的重要调　

控因素…。正常情况下，中心体仅在Ｓ期经历一次和染色　

体ＤＮＡ复制类似的复制；在有丝分裂期中，复制后的两个　中心体分别指导两极纺锤体的形成，从而保证遗传物质在　

两个子细胞中的平均分配。因此，无论任何时候，细胞内仅　

含有一个（未复制前）或两个（复制后）中心体［２　Ｊ。两个以上　

中心体的存在会增加有丝分裂错误的频率并使染色体分配　

不均衡，在癌细胞中普遍存在，被认为是染色体不稳定性、　

非整倍体细胞产生的主要原因之一［３ｌ。另一个调控染色体　

稳定性的重要机制为纺锤体检测点。当细胞内任何着丝粒　与纺锤体微管不恰当地结合或当着丝粒受到来自异常纺锤　

体牵引力时，纺锤体检测点被激活，阻止细胞于有丝分裂　

期，待修复后进入细胞周期。纺锤体检测点功能失活或过　

度激活均是染色体不稳定性的重要原因［４　。　

我们的前期研究发现，食管癌相关基因（Ｅ（、ＲＧ２）基因　

参与中心体复制及纺锤体检测点功能，ＥＣＲＧ２基因缺失引　

起中心体复制异常、纺锤体检测点功能失活，导致染色体不　

稳定性、非整倍体细胞出现。但其机制并不清楚。本研究　

利用质谱分析，鉴定了一个ＥｃＲＧ２基因新的作用靶点　

——ｐ５３。ｐ５３通过其转录活性激活ｐ２１，活化的ｐ２１蛋白　

抑制ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ／ＣＤＫ２激酶活性，从而抑制中心体复制的启　

动ｌ５　；另一方面，ｐ５３通过定位于中心体处，发挥抑制中心　

体再复制的作用＿６』。本研究结果提示，ＥＣＲＧ２基因可能通　

过ｐ５３调控中心体复制，从而在染色体稳定性中发挥重要　

作用。　

１材料和方法　

ＥＣＲＧ２抗体：将ＥＣＲＧ２蛋白肽的Ｃ末端（ＫＳＮＧＲＶ—　

ＱＦＬＨＤＧＳＣ）作为免疫原制备ＥＣＲＧ２单克隆抗体。ＥＣＲＧ２　

单克隆抗体由我室制备，实验方法参考相关文献［５］。　

免疫共沉淀一Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析：用冰冷磷酸盐缓冲液　

洗涤贴壁细胞，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（１　ｎｒｎｏｌ／Ｌ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１０　ｔ－￣ｇ／ｍＬ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１０　Ｎｇ／ｍＬ　ｌｅ—　

ｕｐｅｐｔｉｎ，２５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＦ，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｖａｎａｄａｔｅ）的细　

胞裂解液（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　７．５，１５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，　

５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＧＴＡ，０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ一４０）中裂解细胞。４　℃，１４　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ。用ＥＣＲＧ２抗体或ＩｇＧ（对　

照）免疫共沉淀细胞裂解液（２００～５００　ｔｌｇ蛋白质）４℃过　

基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０５００５８８）；山　

西省自然科学基金资助项目（２００５１０８９）　

通讯作者：成晓龙，ｓｘｃｘｌ＠ｓｉｎａ，ｃｏｉｎ　夜。等量蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、银染。将红色标记蛋白条带　

送质谱分析鉴定。　

２结　果　

ＥＣＲＧ２蛋白作用伙伴的筛选：为进一步明确ＥＣＲＧ２　

调控中心体复制、纺锤体检测点功能的作用机制，我们瞬时　

转染ＨＣＴ一１１６细胞ＥＣＲＧ２表达质粒，２４　ｈ后细胞裂解液　

用于免疫共沉淀实验。以４Ｅ８单克隆ＥＣＲＧ２抗体ＩＰ，免　

疫共沉淀复合物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离，银染。在ＥＣＲＧ２免　

疫沉淀复合物中，发现了４条未知蛋白条带。将该４条蛋　白条带切下，送去质谱分析，鉴定出包括ｐ５３在内的多个　

ＥＣＲＧ２相关蛋白。　ＥＣＲＧ２与ｐ５３相互作用的验证：我们瞬时共转染绿色　

荧光蛋白（ＧＦＰ）一ＥＣＲＧ２、Ｆｌａｇ－ｐ５３表达质粒，２４　ｈ后裂解　

细胞。以ｐ５３抗体ＩＰ、ＥＣＲＧ２抗体Ｗｅｓｔｅｒｎ，在ｐ５３免疫共　

沉淀复合物中检测到ＥＣＲＧ２蛋白的存在，而ＩｇＣ对照未　

检测到任何条带；相反地，以ＥＣＲＧ２抗体ＩＰ、ｐ５３抗体　

Ｗｅｓｔｅｒｎ，同样在ＥＣＲＧ２免疫复合物中发现ｐ５３蛋白，ＩｇＧ　

对照未见条带。以上结果进一步证明了ＥＣＲＧ２与ｐ５３之　

间在细胞内确实存在相互作用。　

３讨　论　ＥＣＲＧ２基因是从河南林县食管癌高癌家族中克隆的　

一个新的候选抑制基因（ＧｅｎＢａｎｋ号ＡＦ２６８１９８）。前期研　

究结果表明，在正常食管、肝、结肠、肺组织中ＥＣＲＧ２基因　

表达，但在相应的肿瘤组织中表达下调或缺失，尤其是在食　

管癌。Ｐｕｌｓｅ－Ｃｈａｓｅ实验表明，ＥＣＲＧ２基因表达后部分分泌　

到细胞外、部分分布于细胞内。细胞内ＥＣＲＧ２基因的功　

能研究发现，ＥＣＲＧ２基因参与中心体复制和纺锤体检测　

点功能。ＥＣＲＧ２基因缺失导致中心体复制异常、多极纺锤　

体出现，纺锤体检测点功能失活，最终导致染色体不稳定　

性、非整倍体肿瘤细胞出现。但其机制并不清楚。本研究　

通过筛选ＥＣＲＧ２相关蛋白，试图寻找ＥＣＲＧ２发挥上述生　物学功能的作用机制。通过质谱分析，我们鉴定出ｐ５３为　

ＥＣＲＧ２的一个新作用靶点，免疫共沉淀实验验证了二者间　的相互作用。已有文献报道ｐ５３在体内参与中心体复制及　

纺锤体检测点功能。ｐ５３通过两条通路参与中心体复制的　

调控，一方面，ｐ５３通过其转录活性激活ｐ２１，ｐ２１是一种　ＣＤＫ抑制剂，活化的ｐ２１蛋白可以抑制ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ／ＣＤＫ２激　

酶活性，ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ／ＣＤＫ的主要功能是启动中心体复制，因此　

ｐ５３通过ｐ２１抑制ｅｙｅｌｉｎ　Ｅ／ＣＤＫ２激酶活性，从而抑制中心　

体复制的启动；另一方面，ｐ５３通过定位于中心体处，发挥　

抑制中心体再复制的作用。另外，ｐ５３已经被发现在纺锤　维普资讯 http://www.cqvip.com 山西医药杂志２００８年８月第３７卷第８期Ｓｈａｎｘｉ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ　２００８，Ｖｏｌ　３７，Ｎｏ．８　・７０１・　

体检测点中发挥重要作用，这一功能司能与ＢｕｂＲ１有关。４　Ｔａｒａｐｏｒｅ　Ｐ，Ｆｕｋａｓａｗａ　Ｋ・Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｐ５３　ａｎｄ　ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ　ｈｙｐｅｍｍ‘　我们的研究结果提示ＥＣＲＧ２与０５３存在相互作用，ＥＣＲＧ２　ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｏｎｅｏｇｅｎｅ，２００２，２１（４０）：６２３４—６２４０－　有可能通过ｐ５３参与中心体复制、纺锤体检测点功能。　５　Ｈｕａｎｇ　Ｇ，Ｗａｎｇ　Ｄ，Ｇｕｏ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ・Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　参考文献　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｃａｎｃｅｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　２　ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｈｙｂｆｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｔ），　１　ｕＭＦ，ＳｔｅａｍｓＴ．Ｍｅｃｈ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｃｅｎｔｒｏｓ０ｍｅ　ｄｕｐｌｉｃａｔｉ０ｎｔ０　２００５，２４（２）：８６—９１－　ｏｎｅ＠ｐｅｒ　ｃｅＩＩ　ｃｙｃｌｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４２（７１０５）：９４７．９５１．　６　ＣｕｉＹ，ｗａｎｇ　Ｊ，ｚｈａｎｇＸ，ｅｔ　ａｌ・ＥＣＲＧ２，ａｌ　ｌ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　０ｆｔｕ一　

２　Ｇｉ０ｌ１０　ＬＥ，Ｍａｎｆ　ＪＪ．Ｔｈｅ　０５３　ｔｕ脚ｒ　ｓｕｐｐｒ￡ｓｓ０ｒ　ｐａｎｉｃｉ阳ｔｅｓ　ｉｎ　ｍＤｒ　ｓｕｐｐｒ￡ｓｓ０　ｇ∞ｅ　ｍ　ｈｅ唧ｈａｇｅａｌ　ｎ０瑚’　ｎ　ｅｍｃｔＳ　ｄｉｒｅｃ　ｌｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｅＵ　ｃｙｃｌｅ　ｃｈｅｃｋ　ｎｔｓ．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈ　ｌ，２００６，２０９（１）：１３．　ｗｉｔｈ　Ｔｎｅ协ｕ０ｔｈｉ０ｎｅ｜ｎ　２Ａ　ａｎｄ　ｌｉｎｋｓ　ｔ０　ａｐｏｐｔ０ｓｉｓ・Ｂ　ｈｅｒｎ　Ｂ．ｏｐｈｙｓ　２０．　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００３，３０２（４）：９０４—９１５・　

３　ＭｕＳ｛ｎａｎ　ＪＧ，Ｈｏｍ　ＨＦ，Ｃａｒｒ（）ｌｌ　ＰＥ，ｅｔ　ａ１．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｉｎｄｕｃｔｉ０ｎ　ｏｆ　（收稿日期：２００８—０６—１１）　ｃ∞ｔ姗ｍｅ　ｈｙｐｅ㈣ｐｌＩｆｉｃａｔ．０ｎ　ｂｙ　ｌ０ｓｓ　０ｆ　ｐ５３　ａｎｄ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ嗍一　作者简介：崔永萍，女，１９７１年９月生，副教授，山西医科大　

ｐｒｅｓｓ｜０ｎ．ｃＩＩｌｏｏｇｅｎｅ，２０００，１９（１３）：１６３５．１６４６．　学，０３０００１　

乳腺癌组织中ＣＤ１０５的表达与Ｋｉ一６７　ＥＲ　ＰＲ　ＣｅｒｂＢ一２　

及同侧腋淋巴结转移的相关性　

江苏省苏州市立医院（２１５００８）　薹　

人们对乳腺癌的认识已达分子水平，肿瘤的分子标记　

是其中重要的一环，它对乳腺癌的诊断、治疗和判断预后具　

有重要的意义，特别是为近年来兴起的分子靶向药物治疗　提供了直接的依据。我们应用免疫组织化学的方法对６０　

例乳腺癌和２０例乳腺良性病变病理标本的ＣＤ１０５、Ｋｉ一６７、　

ＥＲ、ＰＲ、ＣｅｒｂＢ－２五种分子标志进行了回顾性研究，并分析　

它们与同侧腋淋巴结转移等临床病理参数的关系。　

１材料与方法　１．１标本：收集２００１－－２００４年乳腺癌根治标本或改良根治　

术石蜡包埋病理档案乳腺癌标本６ｏ例，术前未经任何化疗　

和抗肿瘤治疗。患者均为女性，年龄２６～７２岁，中位年龄　

４７．５岁。同时收集２００４年良性病变蜡块２０例（乳腺腺病和　

纤维腺瘤各ｌ０例）。　

１．２免疫组织化学染色：４／ａｎ厚连续切片、脱蜡、枸橼酸　

缓冲液（ｐＨ为６．０）微波修复。抗体均购自北京中杉金桥　

生物技术有限公司。采用免疫组织化学二步法染色。每批　

染色均设置阳性、阴性对照。分别用已知高表达的乳腺癌　

组织为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）（０．０１　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　

７．４）替代一抗为阴性对照。　

１．３阳性结果判断及微血管密度（ＭⅧ）计算方法：用阳　

性细胞比例表示Ｋｉ一６７、ＥＲ、ＰＲ、ＣｅｒｂＢ－２的表达程度，即阳　

性细胞数＞ｌ０％为（十）；阳性细胞数＞３０％为（＋＋）；＞５０％　

为（卅）；＞７５％为阳性（｝Ｈ＋）；Ｋｉ一６７、ＥＲ、ＰＲ的阳性表达部　

位在细胞核；ＣｅｒｂＢ－２的阳性表达部位在细胞膜。　

ＣＤ１０５的阳性表达部位在细胞质。按Ｗｅｉｌｄｅｒ等－１．２　Ｊ　

报道的方法算出ＭＶＤ。即：先用１００倍光镜扫视整个切　

片，选出３个微血管密度最高区（热区），在４００倍光镜下计　

数热区被抗ＣＤ１０５染成棕黄色的数目，凡单个孤立的或多　个紧密排列的内皮细胞团，只要与邻近肿瘤细胞及周围结　

通讯作者：郭云娣，Ｅｍａｉｌ：ｇｙｄ１９６４＠１６３．ｃｏｍ　缔组织成分分界清楚，无论有无血管腔，即可计数为１个微　

血管数。取３个视野的微血管数的平均值作为ＭＶＤ。　

１．４统计学处理：应用ＳＰＳＳ　ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ　１２．０统计分析　

软件包进行各组数据的统计分析：ＭＶＤ值以至±Ｓ表示，　

与各病理指标间的关系比较采用￡检验、单因素方差分析；　

Ｋ１６７表达强度和ＭＶＤ间的关系比较采用Ｓｐｅｍｒ￣秩检　验。　

２结　果　

２．１　ＣＤ１０５在乳腺良性病变中的表达及定位：２０例乳腺　

良性病变中ＣＤ１０５的免疫组织化学着色仅在间质血管的　

细胞质上，血管较成熟。其中ｌ０例乳腺纤维腺瘤ＣＤ１０５　

标记的ＭＶＤ值为９±６，１０例纤维腺病ＣＤ１０５标记的　

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p53蛋白表达和基因突变在非小细胞肺癌中的预后意义

p53蛋白表达和基因突变在非小细胞肺癌中的预后意义

p53蛋白表达和基因突变在非小细胞肺癌中的预后意义

王德华;廖松林;高子芬;白逸秋;张惠信;许翔

【期刊名称】《实用肿瘤杂志》

【年(卷),期】1998(13)6

【摘 要】为探讨ｐ５３蛋白表达和基因突变在非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）中的预后价值，免疫组化检测８５例ＮＳＣＬＣ的ｐ５３蛋白表达，聚合酶链式反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法检测３１例肺腺癌ｐ５３基因５、６、７、８外显子突变，研究结果进行单因素生存分析。随访时间的中位数为４７个月，３年、５年总体生存率分别为６６％和６１％。ｐ５３蛋白表达与预后无关（χ２＝１．００，Ｐ＝０．８），而ｐ５３基因突变组病人的生存率显著低于无ｐ５３基因突变组（χ２＝４．８１，Ｐ＝０．０３）。本研究结果提示：在ＮＳＣＬＣ中ｐ５３蛋白表达和ｐ５３基因突变可能有不同的预后意义，ｐ５３基因突变可作为肺腺癌的辅助预后指标。

【总页数】1页(P330-33)

【关键词】非小细胞肺癌;肺肿瘤;P53基因;基因突变

【作 者】王德华;廖松林;高子芬;白逸秋;张惠信;许翔

【作者单位】北京市安贞医院;湖北郧阳医学院;北京医科大学

【正文语种】中 文

【中图分类】R734.2

【相关文献】 1.p53基因突变和蛋白表达改变在食管癌预后作用中的Meta分析 [J], 王小利;张春梅;施侣元;余红平;徐顺清

2.P53癌基因蛋白在原发性非小细胞肺癌（Ⅰ～Ⅲa期）中表达的预后意义 [J],

TanDF;胡瑛

3.EGFR19/21基因突变与NSCLC组织中p53蛋白表达的关系及对预后的影响

[J], 陈焱;宋小平

4.喉癌中P53基因突变与突变型P53基因蛋白表达的相互关系及意义 [J], 刘克杰;王惠忠;张信行

5.组蛋白乙酰转移酶hMOF和p53蛋白在非小细胞肺癌患者中的表达及临床意义

[J], 韩丽丽; 韩性运

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MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展

MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展

MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展

何田丽;马建华;郭加友;马建新

【摘 要】肿瘤抑制基因p53在抑制肿瘤生成中起重要作用.作为p53的主要负性调节因子,鼠双微体(MDM)2能够泛素化降解p53蛋白并降低其活性,而p53则与MDM2的P2启动子序列结合,抑制其转录活性,降低其表达,两者相互作用形成负反馈环.MDMX,又称MDM4,其能够抑制p53的转录激活,调节MDM2的E3连接酶活性,且MDM2与MDMX均具有p53非依赖性致瘤作用.因此探究p53-MDM2、MDMX的相互作用及具体的作用机制可为肿瘤治疗提供新的方向.%The tumor

suppressor p53 gene plays an important role in tumor formation.Murine

double minute (MDM) 2 mediates the degeneration of p53 and decreases

the expression of p53 through its E3 ubiquitin ligase activity.And p53 binds

to the P2 promoter to inhibit the transcription of MDM2,thus form a

negative feedback loop.MDMX inhibits the transcriptional activity of

p53,and it can also regulate the E3 ubiquitin ligase activity of MDM2.Both

MDM2 and MDMX have p53independent tumorigenic

effect.Therefore,exploring the interaction between p53-MDM2 and MDMX

食管癌组织DPP3、SMAC_表达变化及其与临床病理特征和预后的关系

食管癌组织DPP3、SMAC_表达变化及其与临床病理特征和预后的关系

山东医药2024 年第 64 卷第 1 期

食管癌组织DPP3、SMAC表达变化

及其与临床病理特征和预后的关系

朱强1，2，孙彦龙1，2，武毅1，2，王海1，2，王玉璇1，21 山西白求恩医院（山西医学科学院 同济山西医院） 山西医科大学第三医院胸外科，太原030032；

2 华中科技大学同济医学院附属同济医院胸外科

摘要：目的　探讨食管癌组织二肽基肽酶Ⅲ（DPP3）、第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（SMAC）表达变化及其与临床病理特征和预后的关系。方法　选择101例食管癌患者，均接受根治性或姑息性手术治疗，留取术中切除的食管癌组织及其癌旁正常组织，采用免疫组化法检测DPP3、SMAC阳性表达率。分析食管癌组织DPP3、SMAC阳性表达与临床病理特征的关系。出院后随访3年，统计食管癌患者生存情况，比较DPP3、SMAC阳性表达

者与阴性表达者3年生存率。结果　与癌旁正常组织比较，食管癌组织DPP3阳性表达率升高，SMAC阳性表达率降低（χ2分别为49.744、32.020，P均<0.05）。食管癌组织DPP3、SMAC阳性表达与组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关（P均<0.05）。随访3年，无失访病例，期间死亡33例，总生存率为67.33%（68/101）。生存分析显示，DPP3阳性表达者3年生存率低于其阴性表达者，SMAC阳性表达者3年生存率高于其阴性表达者（Log-rank χ2分别为6.342、10.811，P均<0.05）。结论　食管癌组织DPP3高表达、SMAC低表达，二者表达变化与组织分化程度、TNM

分期、淋巴结转移和预后不良密切相关。关键词：食管癌；二肽基肽酶Ⅲ；第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂；临床病理特征；预后doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2024.01.004 中图分类号：R735.1 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2024）01-0016-05

P53基因突变检测方法

P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材)

GIAGEN，德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit（ ）Platinum?Taq DNA Polymerase

High Fidelity（Invitrogen,11304-102 Nuclease-Free Water (Promega,P1195)

d NTP Mix (Promega,P151B)

PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成

DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物) DNA分子定量标准：技术Bioer产物回收纯化试剂盒（BioSpin Gel Extraction kit，日本PCR 有限公司） 公司）Axygen，200~1000 μl吸头（美国ll0.5~10 μ、2~20 μl、20~200 μ、 管EP 、仪器3 ；Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司） Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国） 公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter 型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1 公司，德国）1000μl50 μl、200 μl、（Eppendorf2 μl移液器、10 μl、 NEWAIR公司，美国）Ⅱ级生物安全柜NU425-400E（ 高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Mastercycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR 电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司） 240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan

测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMAN COULTER公司，美国）20μl、200μl和1000μl加样器（吉尔森公司，法国）