RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告
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RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达页数:37
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P53基因的功能页数:5
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P53基因概述页数:4
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p53基因及其功能研究进展页数:5
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P53基因在血细胞中的表达页数:20
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rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
RT PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达
RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达一、实验原理细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。
分离制备RNA 是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA 与其他成分分离，并保证RNA的完整性。
1、Trizol法该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA的方法。
Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。
之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。
2、RNA质量标准RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减少RNA酶对RNA的讲解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度：A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。
PCR3、PCR聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。
利用两段已知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。
其基本过程分为变性、退火、延伸三个步骤。
变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。
每次循环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。
4、RT-PCR反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。
RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。
应用RT-PCR检测III期非小细胞肺癌新辅助化疗中p53mRNA的表达
应用RT-PCR检测III期非小细胞肺癌新辅助化疗中p53mRNA的表达赵东波;陈景寒;彭忠民【期刊名称】《山东大学学报：医学版》【年(卷),期】2005(43)10【摘要】目的:初步探讨III期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中p53mRNA表达与新辅助化疗敏感性及预后的关系。
方法:选取30例行新辅助化疗的III期NSCLC患者,应用RTPCR法分别检测肿瘤与同肺叶正常组织p53mRNA的表达,随访患者生存情况。
结果:①肿瘤组织中p53mRNA表达阳性17例(56.7%),正常组织中3例(10%),二者有统计学差异(P<0.05);②所有患者中位生存时间为18.9个月。
肿瘤组织中p53mRNA阳性者中位生存时间13.1个月,阴性者32.0个月,二者有统计学差别(P<0.05)。
结论:III期NSCLC患者正常组织中p53mRNA呈低表达,肿瘤组织中则呈高表达。
p53mRNA表达可预测新辅助化疗的疗效。
【总页数】4页(P952-955)【关键词】蛋白质,p53;逆转录聚合酶链反应;癌,非小细胞肺;新辅助化疗【作者】赵东波;陈景寒;彭忠民【作者单位】山东大学山东省立医院胸外科;山东省立医院胸外科【正文语种】中文【中图分类】R734.2【相关文献】1.III A期非小细胞肺癌患者新辅助化疗的疗效分析 [J], 柳荫江;薛亮;葛棣;卢春来2.检测P53蛋白表达在Ⅲ期非小细胞肺癌新辅助化疗中的意义 [J], 赵东波;陈景寒;彭忠民3.新辅助化疗对Ⅲ期非小细胞肺癌骨髓中CK19表达的影响 [J], 彭忠民;王善政;张林;冯进波4.LRP表达在Ⅲ期非小细胞肺癌新辅助化疗中的预测意义 [J], 王巍炜;李高峰;王前;陈楠5.ERCC1表达在Ⅲ期非小细胞肺癌含铂方案新辅助化疗中的意义 [J], 王巍炜;李高峰;巫正伟;郭刚;陈楠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
p53基因的原核表达与活性测定
p53基因的原核表达与活性测定李春炎;杨兵;李兴玉;俞亚东【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2009(38)1【摘要】目的原核表达P53重组蛋白,检测P53蛋白对人类白血病细胞系K562增生的影响.方法运用PCR技术鉴定了pET-p53重组质粒导人BL21菌株中p53基因的存在,并在IPTG的诱导下,大量产生外源基因产物.通过Ni-NAT亲和层析柱纯化分离P53蛋白,SDS-PAGE确定该蛋白准确性.以不同浓度的P53重组蛋白诱导K562细胞后,用MTT比色法、集落形成法、流式细胞术(FCM)测定P53蛋白对靶细胞增生的影响.结果成功地构建了含人野生型p53基因的原核表达载体,纯化了P53重组蛋白.活性测定结果表明,随着P53重组蛋白浓度的增加,K562细胞存活率显著降低,并发现该蛋白能促进肿瘤细胞凋亡,且呈现明显的剂量依赖性,经相关分析,细胞抑制率与P53蛋白浓度呈正相关(r=0.8981),其半数抑制浓度(IC50)为6.74μg/ml.结论 P53重组蛋白具有促进K562细胞凋亡的作用.【总页数】4页(P38-41)【作者】李春炎;杨兵;李兴玉;俞亚东【作者单位】200234,上海师范大学生命与环境科学学院生物系;200234,上海师范大学生命与环境科学学院生物系;200234,上海师范大学生命与环境科学学院生物系;200234,上海师范大学生命与环境科学学院生物系【正文语种】中文【中图分类】R4【相关文献】1.籽粒苋C4关键酶丙酮酸磷酸双激酶基因的原核表达及酶活性测定 [J], 贺飞燕;闫建俊;白云凤;冯瑞云;张维锋2.酿酒酵母和大肠杆菌鸟嘌呤脱氨酶基因的克隆、原核表达及活性测定 [J], 孙莹;潘思安;李萌萌;邓威威;张正竹3.叶螨AChE突变型的原核表达及活性测定 [J], 周王艳; 韦显星; 高溯; 杨金; 李博; 王晓琴; 卜春亚4.松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定 [J], 李煜;吴小芹;胡龙娇5.松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定 [J], 李煜;吴小芹;胡龙娇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。
材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。
2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。
3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。
4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。
5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。
实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。
2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。
3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。
4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。
5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。
6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。
结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。
以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。
结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。
这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。
2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理一、 rt-pcr检测基因表达水平的基本原理1. rt-pcr技术是一种用来检测基因表达水平的常用方法，其中rt代表逆转录（reverse transcription），pcr代表聚合酶链式反应（polymerase ch本人n reaction）。
2. rt-pcr技术通过将RNA转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定基因的片段，从而检测基因的表达水平。
3. rt-pcr检测基因表达水平的原理可以分为逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。
4. 逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，通过逆转录酶（reverse transcriptase）的作用，RNA可以被转录成cDNA。
5. 聚合酶链式反应是将cDNA扩增的过程，通过聚合酶和引物（primer）的作用，cDNA可以被扩增成大量的目标片段。
二、 rt-pcr检测基因表达水平的具体步骤1. 提取RNA：首先需要从待检测的组织或细胞中提取总RNA，保证RNA的完整性和纯度对后续实验非常重要。
2. 逆转录：将提取的RNA进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶和随机引物或特异性引物。
3. pcr扩增：将逆转录后得到的cDNA进行聚合酶链式反应，使用特异性引物对目标基因进行扩增。
聚合酶链式反应的过程需要聚合酶、引物和dNTP。
4. 分析结果：最后通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR等方法对扩增产物进行定量和分析，得到基因表达水平的信息。
三、 rt-pcr检测基因表达水平的优缺点1. 优点：rt-pcr检测基因表达水平的灵敏度高，可以检测低表达基因；检测结果定量化准确，能够得到基因的具体表达量；方法简单、快速、高效，适用于大规模的基因表达分析。
2. 缺点：需要严格控制反应条件和引物设计，以避免假阳性结果；受到RNA的完整性和纯度的影响，需谨慎处理RNA样本；无法区分剪接异构体，对于复杂基因的表达分析存在局限性。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告《RT-PCR实验报告》摘要：本实验旨在利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对特定基因进行定量分析。
通过逆转录将RNA转录成cDNA，然后利用PCR技术扩增目标基因，最终通过实时荧光信号检测目标基因的表达水平。
实验结果表明，该技术能够准确、快速地检测目标基因的表达水平，为基因表达研究提供了重要的技术手段。
引言：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测、基因型鉴定等领域。
其原理是利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后利用PCR技术扩增目标基因，最终通过实时荧光信号检测目标基因的表达水平。
本实验旨在利用RT-PCR技术对特定基因进行定量分析，为基因表达研究提供重要的技术支持。
材料与方法：1. 提取RNA：从细胞或组织中提取总RNA，使用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
2. PCR扩增：设计特异性引物，利用PCR技术扩增目标基因。
3. 实时荧光检测：利用实时PCR仪检测PCR反应过程中的荧光信号，得到目标基因的表达水平。
结果与讨论：实验结果显示，利用RT-PCR技术可以准确、快速地检测目标基因的表达水平。
与传统的Northern blot和原位杂交技术相比，RT-PCR技术具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，适用于大规模基因表达分析。
因此，RT-PCR技术在基因表达研究中具有广泛的应用前景。
结论：本实验利用RT-PCR技术对特定基因进行定量分析，结果表明该技术能够准确、快速地检测目标基因的表达水平，为基因表达研究提供了重要的技术手段。
未来，我们将进一步优化实验条件，扩大样本量，深入研究基因表达的调控机制，为相关疾病的诊断和治疗提供更多的理论和实验依据。
细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达
实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨合殷悦涵实验日期：2021.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白〔RNP〕的形式存在。
别离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质别离，然后将RNA同其他的细胞成分别离开并保证RNA的完整性。
Trizol法别离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节防止它的污染。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。
2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过屡次循环是模板上特定DNA 拷贝数呈指数级增长。
根本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。
RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞〔A549和H1299〕中的表达水平。
二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549〔野生型〕和H1299〔p53缺失型〕、p53引物、GAPDH 引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温枯燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定〔一〕RNA提取取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心15min分层→取上层水相入新的Ep管中参加等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min →4℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀→弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀→4℃，12000rpm离心5min→弃上清，晾干，用30μl无RNase水溶解沉淀〔二〕RNA浓度和纯度测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达〔一〕反转录合成cDNA1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管参加样品RNA2μg，以无水RNase水补足体积至9μl，70℃，10min，立即置于冰上。
P53基因在血细胞中的表达
结果分析
用相应的5-8ul DNA Marker,2%琼 脂糖凝胶电泳，电压110-120V， 30-45分钟。 于紫外透视仪下观察有无特异性扩增 带，并照相记录。 β -actin扩增产物大小540bp，340 bp。 GAPDH扩增产物大小142bp。
注意事项
• 双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的 变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。 当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。 • 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如
序列有8个外显子
选择的是3和7两个外显子，上
面数字指这个外显子，该选择
只是为了使其特异性更高，便 于提高实验准确度。
该基因全部碱基序列
这是p53基因的全部碱基序列，
找到3号和7号所对应的序列， 复制其序列，然后打开genbank 所提供的引物设计工具
引物设计步骤
将3号和7号外显子序列复制到右图
最佳引物
根据上述引物设计原则，选择第一个引物序列， 其Tm值符合条件，GC%在合理范围内
血细胞RNA提取
• 1、冰冷的PBS液 5-10ml洗涤细胞两次，加入Trizol 1ml， 混匀，室温静置15min • ２、小滴管吹打，使细胞完全裂解，然后完全转移至1.5ml EP管内 • 3、加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡混匀30s。室温静置10min， 上层水相，下层为酚相 • 4、4度离心，15000rpm，15min • 5、将上层水相移至另一EP管内，400-500ul，切勿吸到蛋白， 加入等量的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。然后4度， 15000rpm，离心10min
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RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告1310301315 张铨一、RT PCR技术1.基本原理聚合酶链反应(PCR)技术是利用DNA聚合酶在体外条件F．催化一对特异引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。
PCR包括三个基本过程：(1)变性，在高温度条件下使双链模板DNA变性、解链，成为两条单链DNA；(2)退火，在较低温度时使加入的引物单链DNA模板特异性结合；(3)延伸，在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3’-OH 端开始．根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子，，这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过若干次循环后，目的DNA片段的拷贝数大最增加。
RT-PCR方法由两部分组成：(1)cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT）16或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段(2)PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，使用上、下游引物在耐热的DNA聚合酶作用下进行标准的PCR扩增。
12.实验方法【实验材料】1．试剂(1)β-actin引物上游引物：5 7一ATG CGA ATT CCC AAC CGT GAA AAG ATG A-3’下游引物：5 7一ATG CGG ATC CGA AGG AAG GCT GGA AAA一3’(2)Promega RT-PCR试剂盒(3)酚／氯仿：1：1混合(4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2(5)无水乙醇2．仪器基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。
3．耗材0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。
【实验步骤】1．反转录合成cDNA(1)RNA预变性(打开RNA二级结构)：取1支0．2ml Ep管加入样品RNA 2μl无RNase水 7μl70℃，10min，立即置冰上。
(2)设置反转录反应体系：向Ep管中加入：MgCl2 4μl10×RT缓冲液 2μldNTP 2μlRNasin 1μl(15U)Oligo dT 1μlAMV反转录酶 1μl混匀。
42。
C，15mira 95。
C，5min终止反应。
短暂离心，将反应物收集于管底，置于冰上。
2．设置PCR反应体系(可在反转录反应进行时配制)(1)取1支0．2ml Ep管，在冰上加入：10×PCR缓冲液 5μldNTP 1μlβ-actin上游引物 1μlβ-actin下游引物 1μlTaq DNA聚合酶 1μl无RNase水 39μl待反转录反应结束后，加入cDNA 2μl(2)设置PCR反应参数为：94℃预变性 5min94℃变性 30s58℃退火 40s72℃延伸 40s共30个循环72℃延伸 10min3．RT_PCR产物鉴定取10μl RT-PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
4．PCR产物的纯化将PCR反应剩余产物合并，用无菌蒸馏水将体积补至200／-1。
加入等体积(200μl)的酚／氯仿，混匀5min，4℃，10 000r／rain离心10min。
取上层水相，加入1／lO体积的醋酸钠(3mol／L，pH5．2)、2倍体积无水乙醇，混匀，室温或一20℃放置30min ；4℃，12 000r／min离心10min，弃上清，待乙醇挥发干净后，溶于10 μl无菌蒸馏水。
一20℃保存备用。
3.应用PCR和RT-PCR技术操作简单，灵敏度高，已广泛应用于基因结构分析、基因表达和基因克隆研究。
RT-PCR主要用于定性或定量检测基因的表达情况以及有关疾病的临床诊断，是分子生物学常用的技术之一。
RT-PCR实质上是对mRNA 的扩增，我们常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
(1)DNA克隆：从混合的模板DNA分子中(如cDNA文库)选择性地扩增靶基因，并在引物末端引入限制性酶切位点或其他特定序列，即可将靶基因克隆到多种表达载体中，以用于进一步的功能分析。
(2)突变分析：通过改变引物与靶基因的互补结合区，可以扩增靶基因中的某个功能域或特殊结构区，克隆表达后可分析该基因缺失子(gene deletion mutant)的功能。
改变引物设计还可以得到定点突变的基因变异体(site-directed mutagenesis)。
(3)基因融合：选择性扩增两个(或多个)基因(或其特定结构域)，在各自的引物中加入相匹配的限制性内切酶位点，扩增后的产物经酶切及连接反应，即可得到所需的融合基因。
(4)基因半定量：在反应条件一定且循环数较少的情况下，PCR的产物量与样本所含的模板量成正比，此时PCR可以用于初步的基因定量分析。
实时PCR(real time PCR)可以实时监测PCR反应的进行，控制循环次数在定量所需范围内，因此可以用于更为准确的量化分析。
(5)疾病的诊断和法医学鉴定：PCR技术因其高度的灵敏性、特异性和操作简便快速等突出优势，已经被广泛应用于疾病诊断和法医学鉴定。
PCR可以检测遗传病患者是否有特定的基因突变，感染疾病患者体内是否存在细菌或病毒等相关遗传物质，为下一步针对性的治疗提供直接依据。
在法医学上，PCR扩增微量残留DNA并结合DNA指纹、杂交等分子生物学手段，已成为一种行之有效的甄别个人身份的方法。
PCR甚至可以对几百万年前留下的动物残骸进行DNA扩增，使其在考古学、进化生物学等领域亦得到广泛的应用。
2二、real time RT-PCT技术1.基本原理实时定量PCR(real—time quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR指数扩增进程，通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。
“实时”是指在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，我们可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和Ct值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上，但一般我们将荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值(threshold value)。
Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时PCR技术较之于以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。
首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。
其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性，并且无需在扩增后进行操作，而且由于扩增产物的检测在PCR扩增过程中同时进行，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省许多。
另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。
实时荧光PCR技术基于荧光共振能量迁移(fluorescent reso—nance energy transfer，FRET)原理：当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移到相邻的低能量荧光基团上。
由于标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以反映PCR扩增产物的数量变化，从而使得荧光PCR技术可以起到实时检测的目的。
32.应用1．微小残留病变的检测肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。
虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。
因此微小残留病变(MRD)的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。
Real—time Q—PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。
通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。
2．细胞因子的表达分析细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应(包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系统中起着核心作用。
许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。
为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。
尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而real—time反转录PCR(RT—PCR)以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。
3．肿瘤耐药基因表达的研究对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。
由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞的耐药机制就变得十分重要。
多药耐药(MDR)是多因素，多种机制共同作用的结果。
real—time反转录PCR(RT—PCR)是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。
4．病毒感染的定量监测扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。
Real—time Q—PCR是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术，它不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使临床医生和病毒学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。
目前运用较多的是在器官移植中对使用免疫抑制剂的病人用Real—time Q—PCR 来定量测定CMV感染。