鹅细小病毒YG株的鉴定及在器官中的分布_邵周伍林

462020年第9期 吉林畜牧兽医·禽业专栏·QinYe ZhuanLan免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究于昌贵天津市中升挑战生物科技有限公司，天津 300380摘 要：利用免疫酶组织化学染色法将雏鹅进行人工感染GPV，在不同阶段病毒抗原在体内的分布状况具有不同的特点，采用影像学技术对其予以定量分析后，雏鹅于感染1～21 d 可在各器官中检测到病毒抗原体，而其中在5 d 时，感染分布较为广泛，因此抗原出现染色效应的最大，待检组织中空肠具有较高的检出率，而病毒抗原因此广泛存在消化道的各种上皮细胞中，由此可知上皮细胞为GPV 重要的靶细胞。

关键词：鹅细小病毒；间接免疫酶组织化学法；染色强度鹅细小病毒（GPV）在细小病毒科中可诱发鹅细小病毒病，是一种可感染雏鹅或者番鸭的传染性疾病[1]。

此疾病多发于3～20 d 内出生的雏鹅。

目前，小鹅瘟在流行趋势以及发病特点上具有较为新颖的观点。

1 试验方法1.1 动物分组与病毒接种准备将66只14 d 雏鹅随机分为2组，观察组（感染GPV）40只，对照组26只。

观察组中对雏鹅予以肌肉注射0.1 mL、口服0.5 mLGVP 尿囊液；另一组予以统计量的生理盐水。

1.2 取样将GPV 感染的雏鹅进行不同时段取病变样本，将所有病变组织进行标记后可在-20 ℃予以保存。

1.3 免疫组化法的应用主要通过进行优化后的间接免疫酶组织化学法对其进行处理，可将样本进行切片在载玻片上固定后，进行胰蛋白酶修复以及洗涤切片，当完成标本制作后，在电风扇下将标本吹干或利用温箱烤干标本，若二甲苯表现出透明性状，则可予以树胶封片。

1.4 定量分析对染色样本的阳性强度检测，若强度表现高，则代表阳性征具有更强的效果，本次结果以“均数±标准差”表示。

2 感染原因与结果分析2.1 不同时段的器官组织病变动态分析检测组织诊断主要应用免疫酶组织化学染色后，在电子显微镜下对其进行切片，再对感染结果进行分析。

鹅细小病毒强毒株XKY10株的分离、鉴定及其生物学特性分析毛文智;邵洪泽;姚新华;高洪伟;孙健;许志林【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(39)3【摘要】采用电镜观察、PCR检测、血液凝集和琼脂扩散方法来鉴定从白城某养鹅场10日龄雏鹅具有典型症状的雏鹅肝脏、脾脏和肠组织中分离的一株病毒；通过测定此病毒最小致死量致死鹅胚的平均时间(MDT)和鹅胚半数致死率(ELD50)来分析其毒力.鉴定结果表明,该病毒为鹅细小病毒.毒力分析结果表明,该毒株为强毒株.%Using electron microscopy, PCR testing, blood agglutination and agar method to identify a virus isolated from the liver, spleen and intestinal tissue having typical symptoms in the 10-day-old goslings goose from a goose farm in Baicheng, and then measured the minimum death dose of goose embryo lethal average time (MDT) and the half goose embryo lethality (ELD50) to analyze the virulence. The identification results indicate that the virus is goose parvovirus, and the virulence analysis shows that this strain is a virulent strain.【总页数】3页(P171-173)【作者】毛文智;邵洪泽;姚新华;高洪伟;孙健;许志林【作者单位】吉林省畜牧兽医科学研究院家禽研究所,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院家禽研究所,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院家禽研究所,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院家禽研究所,吉林长春130062;吉林省畜牧兽医科学研究院家禽研究所,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院家禽研究所,吉林长春 130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2【相关文献】1.1株鹅细小病毒强毒株的分离与鉴定 [J], 涂飞;宋娜;石亚运;吕亚楠;邵红霞;钱琨;金文杰;秦爱建2.13株新城疫病毒强毒株的分离鉴定及部分生物学特性 [J], 连宏军;闫丽辉;刘培欣;曹殿军;韩正博;孙建宏;梁宏志3.一株鸡新城疫强毒株的分离及生物学特性鉴定 [J], 马亚珍;兰玲;王涛4.鹅细小病毒强毒YBLJ分离株的分离鉴定与vp3基因的进化分析 [J], 高旭;张颖;鲁承5.一株鸡新城疫强毒株的分离及生物学特性鉴定 [J], 钱晨;张建军;宋振华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析贺冬梅;谭树义;陈朝喜;叶保国;张艳;林哲敏;曹宗喜【摘要】为研究鹅细小病毒（GPV）基因遗传变异特征，采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料，将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒，经 PCR 鉴定为鹅细小病毒，命名为 HN 株，并获得了其全基因组序列，将该序列与GenBank 数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。

结果显示，该株病毒基因组全长为5106 bp，由 ITR、NS、VP 构成，其中 ITR 为444 bp，NS1为1844 bp，VP1为2199 bp；HN 株与 SHFX1201株的 NS1基因和 VP1同源性最高，分别达到99．8％和99．7％，与番鸭细小病毒株 FM 的NS1基因同源性最低，为82．7％；与90-0215株 VP1同源性最低，为80．1％。

HN 株的遗传进化树可以看出，GPV 可以分成明显的2个基因亚群，HN 株与鹅细小病毒匈牙利株（B）、欧洲疫苗株（VG32／1）和台湾株（82-0321V、82-0321、06-0329）均处在第 I 亚群，且与安徽分离株 Y 株以及SHFX1201株同源性最接近，番鸭源匈牙利株 FM 单独处于第Ⅱ亚群。

本研究丰富了 GPV 的数据资料，为研究 GPV 分类地位以及遗传进化关系提供了依据，同时也为研究 GPV 流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。

%To investigate the variation status of goose parvovirus,the samples(liver,spleen and so on)of suspected GPV infection were collected from a goose farm of Hainan province.A virus strain was isolated by inoculation of goose embryo after treatment,and named as HN strain after PCR.The complete genomic sequence was obtained,and compared with the sequences of sixteen strains of goose parvoviruses and Mus-covy duck parvovirus in GenBank.The results showed that the full-genome contains the invertedterminal repeat (ITR)and two major open reading frames (ORF).ITR at the 5′and 3′ends of the genome has 444 nucleotides (nt).The left ORF contains 1884 nts in length,the right ORF contains 1 884 nts in length. The nucleotide sequences of HN strain showed the highest homology with NS1 gene and VP1 gene of SHFX1201 strain,with 99.8% and99.7%,respectively.And the homologies with the NS1 gene of FM strain and VP1 gene of 90-0215 strain were lower,with 82.7% and80.1%,respectively.Phylogenetic tree of HN strains demonstrated that GPV can be obviously divided into two gene subsets.HN strain and B strain from Hungary and VG32/1 strain from European are located in the subgroup I,and the high homolo-gy with Y strain isolated from Anhui and SHFX1201 strain,the Muscovy duck parvovirus of FM strain iso-lated from Hungary located in the subgroup II.This study provided a basis for the study of the relationship between GPV classification status and genetic evolution,and laid the foundation for the study of GPV epi-demic trends and vaccine development.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)012【总页数】6页(P13-18)【关键词】鹅细小病毒;分离鉴定;全基因组;IRT;NS1;VP1【作者】贺冬梅;谭树义;陈朝喜;叶保国;张艳;林哲敏;曹宗喜【作者单位】海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100; 西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041;海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100;西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041;海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100;海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100;海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100;海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2鹅细小病毒病又称小鹅瘟(Derzsy′s disease or Gosling plaque)，是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)所引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。

感染鹅细小病毒后雏鹅组织器官的3种消化酶及同工酶朱新产;韩彬;杨丽金【摘要】鹅细小病毒(GPV)侵染引发机体酶或酶蛋白的变化,扰动平衡的代谢网络,调节多种代谢生理活动,其变化多样性和复杂性是研究病毒基因型与宿主遗传易感性互作病理学机制的有效标记物.通过鹅细小病毒YZ毒株(GPV-YZ)感染雏鹅,采用分光光度法分析脑、心、肝、肺、脾器官组织的蛋白酶、淀粉酶及转氨酶活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定同工酶.结果显示,与对照组(CK)相比,受GPV感染雏鹅的各器官组织中,3种消化酶的活性分别增强1.6～6倍、1～2倍、2～3.6倍.淀粉酶同工酶存在4～7条不等的谱带变化,肝和脾新增1条慢区主带,而心脏缺少1个慢区谱带;转氨酶同工酶在慢区显示1条谱带,酶蛋白在慢中区谱带增多2～3条,而脑和脾脏的快区酶蛋白谱带减少1～2条.提示:慢区淀粉酶同工酶可能是GPV感染的敏感同工酶,酶蛋白/同工酶基因不同程度表达差异变化,直接或间接控制感染雏鹅的调节代谢生理机能,增强对入侵GPV的防御应激性能.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)006【总页数】9页(P1-9)【关键词】雏鹅;鹅细小病毒;蛋白酶;淀粉酶;转氨酶;同工酶【作者】朱新产;韩彬;杨丽金【作者单位】青岛农业大学生命科学学院,山东省高校植物生物技术重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学生命科学学院,山东省高校植物生物技术重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学生命科学学院,山东省高校植物生物技术重点实验室,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】S852.33小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)导致的一种败血性传染疾病，表现为渗出性肠炎以及肝、心等器官的炎症，病程短、传播快，具有很强的传染力和致病性，感染GPV的雏鹅，1周内的死亡率达100%，是严重危害养鹅业健康发展的最主要传染病之一 [1-2]。

鹅细小病毒BC1105株的分离鉴定李琳;姚新华;邵洪泽;许志林【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(39)2【摘要】2011年5月中旬在吉林省白城地区的某养鹅场疑似小鹅瘟病死雏鹅的肾脏、肝脏、脑和脾脏组织中分离到1株病毒,选用未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产的14日龄鹅胚,进行鹅胚接种试验,连续传代、血凝试验、琼脂扩散试验、电镜观察、PCR鉴定和动物回归试验,初步确定该病毒为鹅细小病毒,命名为BC1105株.%A strain of virus was isolated from the kidney, liver, brain and spleen tissue of dead goose which had similar symptoms to gosling plague on a big goose farm of Jilin Baicheng in the middle of May 2011. The results of contiguous passage of goose embryos, hemagglutination test,agar-gel immunodiffusion test, electron microscope observation, PCR identification and goose recurrent infection suggested that the virus was goose parvovirus virus. And it was named BC1105 strain.【总页数】3页(P167-169)【作者】李琳;姚新华;邵洪泽;许志林【作者单位】吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130062;吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析 [J], 贺冬梅;谭树义;陈朝喜;叶保国;张艳;林哲敏;曹宗喜2.江苏省盐城市3株白羽肉鸭源鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因遗传进化分析 [J], 李亚非;潘金金;陈洪益;陆红霞;刘东;刘红祥;陈先亮;徐全刚3.鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析 [J], 孟繁兴;董浩;胡振林;徐浩;邵洪泽;胡桂学4.红毛鸭胚源鹅细小病毒江西株的分离鉴定与NS基因的分析 [J], 傅秋玲;陈翠腾;李海琴;黄瑜;傅光华;万春和;韦启鹏;陈红梅;黄江南;程龙飞;施少华;刘荣昌5.1株鹅细小病毒的分离鉴定及致病特性、VP基因特征分析 [J], 刘宝山;李珮瑶;许莉莉;高晶萍;张瑞华;徐彤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布规律研究的开题报告一、研究背景和意义鹅细小病毒是一种引起鹅细小病的病原体，对于养殖业产生了严重的危害。

针对该病的研究已有一定进展，但目前对于其在感染雏鹅体内的分布规律仍存在较大的不确定性。

因此，本研究旨在通过免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内的分布情况，为疫病的防治提供科学依据。

二、研究内容和方法本研究拟采用以下方法：1. 动物模型建立：选择健康2日龄的雏鹅，随机分为实验组和对照组，实验组采用鹅细小病毒进行感染。

2. 免疫组化检测：采用免疫组化方法检测不同组织中的鹅细小病毒抗原表达情况。

3. PCR检测：采用PCR方法检测不同组织中的鹅细小病毒DNA含量及其分布情况。

三、研究预期结果通过免疫组化和PCR方法检测，可了解鹅细小病毒在感染雏鹅体内的分布规律，包括其寄生在哪些组织和器官中，以及抗原表达和基因含量的差异等。

因此，本研究可以为探究鹅细小病的发病机制提供理论支持，并对疫病的及时防治提供依据。

四、研究进度安排本研究计划拟定为12个月，进度安排如下：第1-2个月：收集阅读文献，撰写开题报告。

第3-4个月：准备实验材料和介绍鹅细小病毒育苗。

第5-6个月：建立病毒感染动物模型。

第7-8个月：使用免疫组化方法检测实验组和对照组组织中的鹅细小病毒。

第9-10个月：使用PCR方法检测实验组和对照组组织中的鹅细小病毒。

第11-12个月：整理实验数据，撰写实验报告和论文。

五、预期成果和应用前景本研究通过免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布规律，对该疫病的发病机制和防治提供了新的理论支持。

此外，该研究还可以推动相关领域的研究发展，为养殖业的疾病控制和预防提供更加科学的依据。

鹅细小病毒的分离鉴定及LAMP快速检测方法的建立的开
题报告
一、研究背景
鹅细小病毒 (goose parvovirus, GPV) 是一种常见的鹅病毒，主要感染幼鹅，繁殖期鹅群及良种鹅，病死率高达 100%，严重影响了鹅养殖业的发展。

目前，GPV 的传统检测方法主要为病毒分离、鸭胚接种、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 等，周期长、操作繁琐、耗费时间和经济成本高。

因此，需要建立一种快速、简便、特异、灵敏、准确的 GPV 直接检测方法，为临床诊断提供便利。

二、研究目的
1. 分离鉴定 GPV 病毒株。

2. 建立 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) 技术快速检测 GPV 的方法。

三、研究方法
1.病毒分离与鉴定：用 RT-PCR 方法检测 GPV 病毒并对其进行鉴定，然后进行病毒分离，对分离后的病毒进行组织培养和电镜观察等手段进行病毒的形态和生物学特性的研究。

MP 技术的建立：采用 GPV 的特异性引物设计，优化反应体系，建立一种适用于 GPV 直接检测的 LAMP 技术。

MP 技术的验证：将建立好的 LAMP 技术与传统的病毒检测方法进行比较，评估其特异性、灵敏度、准确性等性能参数。

四、研究意义
1. 该研究将为 GPV 的快速检测提供新的方法，为 GPV 的防治提供科学参考。

2. LAMP 技术具有操作简便、成本低廉、检测时间短、特异性高等优点，能够有效地提高 GPV 的检测效率，降低鹅养殖业的经济损失。

3. 本研究具有推广和应用的价值，对提高我国鹅养殖业的发展质量和水平，减少养殖业的经济损失具有重要意义。

河南农业科学,2020,49(7):126-132Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2020.07.017收稿日期:2019-12-11基金项目:河北省第二期现代农业产业技术体系蛋肉鸡创新团队建设专项(HBCT2018150207)作者简介:刘宝山(1966-),男,河北滦平人,高级畜牧师,本科,主要从事动物疫病防控相关工作㊂E -mail:lp8581466@通信作者:徐㊀彤(1969-),男,河北承德人,教授,博士,主要从事动物流感病毒诱导肺损伤机制研究㊂E -mail:xutong1969@1株鹅细小病毒的分离鉴定及致病特性㊁VP 基因特征分析刘宝山1,李珮瑶2,许莉莉1,高晶萍2,张瑞华2,徐㊀彤2(1.滦平县农业农村局,河北滦平068250;2.河北北方学院预防兽医学重点实验室,河北张家口075000)摘要:为了解鹅细小病毒(GPV )在河北省的流行情况及分子遗传特征,对临床发病承德白鹅疑似小鹅瘟病料进行病毒分离鉴定及致病性㊁VP 基因特征研究㊂结果显示,从病料中分离到1株GPV ;人工感染6日龄雏鹅,感染后96h 全部死亡,临床症状和剖检变化与发病鹅相似;将测序序列拼接后得到VP 基因片段,长度为2475bp ,包含VP1㊁VP2㊁VP3等3个开放阅读框,根据遗传进化分析和同源性分析结果发现,分离到的GPV (HB 株)处于Ⅰb 亚洲群;HB 株与GPV 各毒株VP 基因相似性在96.6%~99.7%,其中与SHFX1201㊁Y 株的氨基酸相似性最高,达99.7%㊂以上结果表明,HB 株与国内分离GPV 毒株之间差异较小,在分子生物学上证明了GPV 只有1个血清型的观点㊂关键词:承德白鹅;鹅细小病毒;致病特性;VP 基因;分子特征中图分类号:S855.3㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)07-0126-07Isolation,Identification and Pathogenicity and VP Gene Characterization of Goose Parvovirus from Chengde White GooseLIU Baoshan 1,LI Peiyao 2,XU Lili 1,GAO Jingping 2,ZHANG Ruihua 2,XU Tong 2(1.Luanping Agricultural and Rural Bureau,Luanping 068250,China;2.Key Laboratory of Preventive VeterinaryMedicine,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China)Abstract :In order to understand the prevalence and molecular genetic characteristics of goose parvovirus(GPV)in Hebei Province,in this experiment,virus isolation,pathogenicity and VP gene characteristicswere studied using clinically ill Chengde white goose.The results showed that a GPV strain was isolatedfrom the disease material.Artificially infected 6-day-old goslings died at 96h after infection,and clinical symptoms and necropsy changes were similar to those of the diseased goose.The sequence of the VP gene was spliced,and sequence with length of 2475bp was obtained,including VP1,VP2,VP3three openreading frames.According to genetic evolution analysis and homology analysis,it was found that the isolated GPV HB strain belonged to the Ⅰb Asian group in the genetic evolution tree.The similarity of VPgene between HB strain and other GPV strains was 96.6% 99.7%,and the amino acid similarity with SHFX1201and Y strains was the highest (99.7%).The above results indicate that,the difference between the HB strain and the domestically isolated GPV strains is small,and the viewpoint that the GPVhas only one serotype is confirmed in molecular biology.Key words :Chengde white goose;Goose parvovirus;Pathogenic characteristics;VP gene;Molecular char-acteristics㊀第7期刘宝山等:1株鹅细小病毒的分离鉴定及致病特性㊁VP基因特征分析㊀㊀鹅细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的可在鹅和番鸭中流行的急性或亚急性败血性传染病,又称小鹅瘟[1],主要侵害4~20日龄雏鹅或雏番鸭㊂该病传播速度快且病死率高,其特征性病理变化为空肠和回肠的纤维素性坏死性肠炎,坏死脱落的肠黏膜与凝固的纤维素性渗出物形成栓子堵塞肠道[2]㊂GPV最早由我国学者方定一在江苏地区发现[3],随后迅速传播到全国各地㊂小鹅瘟是鹅养殖业中不可忽视的传染病,每年都有不同程度的流行,给鹅养殖业造成了严重的经济损失㊂承德白鹅是经多年选育形成的地方优良品种,在河北承德地区均有饲养㊂承德白鹅是中小型品种鹅,适应性强,耐寒耐粗饲,抗病性强,其肉质鲜嫩,适口性好,并且蛋白质含量高㊁脂肪含量低,对人体健康十分有益[4-5]㊂承德白鹅主要由当地农户散养,因缺乏防疫和品种保护意识,鹅的数量减少,养殖效益受损㊂随着我国经济的快速发展和人们生活水平的提高,人们对饮食健康的要求越来越高,禽产品在饮食结构中占比例越来越大㊂GPV感染雏鹅导致的死亡率高达90%~100%[6],成为承德白鹅养殖和繁育中的巨大威胁㊂2018年7月,承德某农户家中饲养的10日龄雏鹅出现大量死亡㊂对该农户家中疑似GPV感染发病的承德白鹅进行实验室诊断㊁病毒的分离鉴定及致病特性研究,以期为日后承德白鹅小鹅瘟的防控提供参考㊂1㊀材料和方法1.1㊀材料1.1.1㊀病料及供试动物㊀疑似GPV感染的病料由河北承德某农户提供;鹅胚购于张家口市某农户; 6日龄雏鹅由河北北方学院预防兽医学重点实验室自行孵化㊂1.1.2㊀主要试剂㊀GPV标准诊断抗原和标准抗体均购自上海莼试生物技术有限公司;营养琼脂㊁麦康凯培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司;聚乙二醇6000购自天津市永大化学试剂有限公司; TIANamp Genomic DNA Kit㊁TIANgel Midi Purifica-tion Kit等均购自天根生化科技有限公司;RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0㊁Taq㊁DL2000Marker等均购自TaKaRa(大连)有限公司;50ˑTAE购自北京索莱宝科技有限公司;乙醇㊁氯仿㊁异丙醇等均购自天津光复精细化学研究所有限公司㊂1.2㊀方法1.2.1㊀背景调查㊀2018年7月,承德某农户家中孵化的承德白鹅出现大量死亡㊂据该农户叙述,自行孵化的承德白鹅在孵化后3d开始出现精神萎靡㊁不愿走动㊁食欲不振㊁饮水增加,5~7d出现大量死亡,临床可见病鹅排水样白色稀粪㊁泄殖腔周围被毛被粪便污染㊁鼻孔内有浆液性黏液㊁喙部呈暗紫色,剖检可见肝脏肿大变脆,心肌苍白,在消化道出现小鹅瘟典型症状,空肠和回肠的坏死性肠炎,坏死脱落的肠黏膜与纤维素性渗出物形成栓子堵塞肠道㊂鉴于上述临床症状和剖检变化,初步怀疑该病是由GPV感染引起的,为进一步确诊该病进行实验室诊断㊂1.2.2㊀细菌分离㊀无菌采集发病鹅的肝脏㊁肺脏㊁脾脏㊁肾脏等脏器,在超净工作台中接种于普通琼脂和麦康凯培养基中,37ħ温箱培养18~24h,观察是否有细菌生长及菌落颜色㊁形态等㊂1.2.3㊀病毒分离㊀采集发病鹅的心脏㊁肝脏㊁肠道等组织,研磨离心,经抗生素过夜处理后过滤除菌,经尿囊腔接种鹅胚,每胚接种0.3mL,去除24h内死亡鹅胚,观察120h,收集鹅胚尿囊液,盲传3代,将收集的病毒尿囊液备用㊂1.2.4㊀病毒鉴定㊀将扩增的病毒尿囊液纯化㊁浓缩后作为待检病毒,以GPV标准诊断抗原为阳性对照,通过琼脂扩散试验鉴定待检病毒㊂1.2.5㊀致病性试验㊀将10枚鹅胚随机分为试验组和对照组,每组5枚㊂鹅胚孵化后饲养至第6天,接种分离的病毒尿囊液,试验组每只肌肉注射0.2mL 尿囊液,对照组相同途径注射0.2mL生理盐水㊂将上述雏鹅隔离饲养,观察其临床症状并统计死亡情况㊂1.2.6㊀分子特征分析1.2.6.1㊀引物设计㊀根据GenBank中已公布的GPV标准株B序列基因序列,设计2对特异性引物(表1),扩增VP基因,预计VP1片段大小1397bp, VP2片段大小1273bp,引物由上海生工生物有限公司合成㊂1.2.6.2㊀PCR扩增㊀按照TIANamp Genomic DNA Kit说明书提取病毒DNA,采用50μL体系进行PCR扩增:10ˑPCR Buffer5μL,dNTPs4μL,Taq 0.25μL,DNA模板2μL,上㊁下游引物各1μL,用水补至50μL㊂扩增条件:94ħ5min;94ħ30s, 55ħ1min,72ħ2min20s,进行30个循环;72ħ10min,最后4ħ保存㊂PCR反应结束后,取5μL 反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测㊂721河南农业科学第49卷表1㊀VP 基因的PCR 扩增引物序列Tab.1㊀Primer sequence of PCR amplification of VP gene片段Fragment 序列(5ᶄ 3ᶄ)Sequence 片段大小/bp Fragment size位置Position VP1P1:ATGACGCTGCGCTTTGCATACTTATGAC P2:ATAGCACTCCGGTCATTGAATCGTGC 13972182 3578VP2P1:ACGCGAAGACCATTGCAAACAATCTC P2:ATAGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTGC12733384 4656㊀㊀按TIANgel Midi Purification Kit 说明书进行DNA 回收,取2μL 回收产物进行电泳检测,由华大基因公司进行测序㊂1.2.6.3㊀VP 基因序列分析㊀采用DNAStar 软件将测得的序列进行拼接,获得完整VP 基因序列,用MegAlign 秩序进行氨基酸同源性的分析,利用MEGA6.06软件对分离到的毒株与GenBank 中已公布的其他不同种属的GPV(表2)进行序列比对分析㊂表2㊀GPV VP 基因序列参考毒株相关信息Tab.2㊀Reference information of VP gene sequence of GPV病毒Virus 毒株Strain 宿主Host 分离年份Separation year 来源Source 致病性Pathogenic 登录号Accession No.蛋白质编号Protein IDGPVSHFX1201天鹅2012中国(上海)致病KC478066AGG56528YZ99-6鹅1999中国致病KC996730AGT62583SYG61v 鹅中国疫苗KC996729AGT62581SH鹅2009中国(上海)致病JF333590AEL8777882-0321v 鹅1982中国(台湾)疫苗EU583389ACE9584982-0321鹅1982中国(台湾)致病EU583390ACE95851GDa 鹅1978中国(福建)疫苗HQ891825AEV89790VG32/1鹅 中国(台湾)疫苗EU583392ACE95855B 鹅1960匈牙利致病U25749AAA83230Y番鸭2011中国(安徽)致病KC178571AGO17638E鹅2012中国(安徽)致病KC184133AGO17640GD 中国致病AY512830AAS16481D雏番鸭 中国致病JF926696AER25359SHM319灰雁1960德国致病U34761AAA75286D146/02 2002法国致病AY496906AAS77517Hoekstra法国疫苗AY496907AAS77518Pusztafoldvar /791979匈牙利致病AY496903AAS77514Csongrad /801980匈牙利致病AY496902AAS77513MDPVSAAS -SHNH 番鸭2012中国致病KC171936AGG53768MDPV -GX5番鸭2011中国致病KM093740AIR74894FM番鸭1980s匈牙利致病NC -006147YP_068411㊀注: 表示GenBank 中无此项信息记录㊂㊀Note: means that there is no record of this information in GenBank.2㊀结果与分析2.1㊀发病鹅细菌分离㊀普通培养基和麦康凯培养基中均未见有细菌生长,表明雏鹅未有细菌感染㊂2.2㊀发病鹅病毒分离鉴定㊀接种病料的鹅胚接种110h 后死亡2枚,其余鹅胚未死亡,但尿囊膜增厚㊁部分有尿酸盐沉积㊂将鹅胚解剖后发现,鹅胚胚体有大量出血点,肝脏呈黄红色,有血斑及坏死灶,心肌苍白㊁肾脏肿胀(图1)㊂将上述尿囊液收集浓缩后进行琼脂扩散试验,GPV 标准抗原与标准抗体反应后,在24h 出现明显白色沉淀线,待检抗原与标821㊀第7期刘宝山等:1株鹅细小病毒的分离鉴定及致病特性㊁VP 基因特征分析准抗体在28h 出现白色沉淀线,表明分离到的病毒是GPV,将其命名为HB 株㊂2.3㊀分离病毒致病性试验㊀试验组在感染后28h死亡2只,48h 死亡1只,96h 死亡2只,死亡鹅与临床雏鹅症状表现及剖检变化相似(图2),均表现白色下痢㊁精神萎靡㊁呆立㊁不愿行走;剖检可见肝脏呈黄红色,肾脏肿大,肠壁变薄,肠道有纤维素性渗出物形成肠道栓塞㊂A.心肌苍白;B.颈部皮肤出血;C.肝脏肿大㊁出血;D.胸肌出血A.Myocardial paleness;B.Neck skin bleeding;C.Liver enlargement and bleeding;D.Pectoral muscle bleeding图1㊀鹅胚剖检变化Fig.1㊀Necropsy change of gooseembryosA.肠道栓塞;B.肠壁变薄㊁出血㊁白色下痢;C.肾脏肿大;D.肝脏出血A.Intestinal embolism;B.Intestinal wall thinning,bleeding and white diarrhea;C.Kidney enlargement;D.Liver bleeding图2㊀感染鹅剖检变化Fig.2㊀Necropsy change of infected goose2.4㊀分离病毒分子特征分析2.4.1㊀VP 基因PCR 扩增结果㊀根据设计的2对特异性引物,扩增出的2个片段大小分别约为1397bp 和1273bp,如图3所示,扩增出的片段与目的片段一致㊂将测序结果拼接后得到VP 片段长度为2475bp,包含VP1㊁VP2㊁VP3等3个开放阅读框(ORF),其大小分别为2199㊁1764㊁1605bp㊂M:DL2000Marker;P1:VP1片段产物;P2:VP2片段产物M:DL2000Marker;P1:VP1fragment product;P2:VP2fragment product图3㊀VP 基因PCR 扩增结果Fig.3㊀The PCR amplification results of VP gene2.4.2㊀VP 基因遗传进化树分析㊀将获得的VP 基因序列与GenBank 中已发表的21株细小病毒进行比较,应用MEGA 6.06软件(NJ 法)绘制VP 基因的遗传进化树㊂从图4可以看出,供试细小病毒分为GPV㊁MDPV 2个大分支,MDPV 分支中中国的GPVD 株宿主为番鸭,推测可能是GPV 感染番鸭后在其体内发生变异,故在分群中处于MDPV 分支㊂GPV 分为2个基因亚群,其中Ⅰa 群中毒株大多为匈牙利㊁法国等欧洲毒株,为欧洲亚群;Ⅰb 群为亚洲群,Ⅱ群则主要是疫苗毒株㊂本研究分离毒株HB 株(用Ә表示)处于Ⅰb 亚洲群㊂2.4.3㊀VP 基因编码氨基酸相似性㊀采用DNAStar 软件中MegAlign 程序将分离毒株HB 株与表2中氨基酸序列进行相似性比较,结果如图5所示,氨基酸相似性在86.7%~99.7%,GPV HB 与GPV 各毒株VP 基因氨基酸相似性在96.6%~99.7%,其中与SHFX1201㊁Y 株的相似性最高,达99.7%;HB 株与MDPV 毒株氨基酸差异较大㊂可见,GPV VP 基因较为稳定,氨基酸差异不大㊂921河南农业科学第49卷Ә表示分离毒株HB 株Әindicates isolated HB strain图4㊀HB 株VP 基因遗传进化树Fig.4㊀Genetic evolution tree of VP gene of HBstrain图5㊀HB 株VP 基因推导氨基酸序列同源性分析Fig.5㊀Derivation homology of amino acid sequence encoded by VP gene of HB strain3㊀结论与讨论本试验从河北承德地区的承德白鹅中分离到1株病毒,琼脂扩散试验结果显示,分离毒株为GPV㊂致病性试验结果显示,试验组6只雏鹅在感染后96h全部死亡,死亡率为100%,并表现与临床发病鹅相似的症状和剖检变化,即肝脏㊁肾脏㊁脾脏肿大,肠壁变薄,肠道有纤维素性渗出物形成的肠道栓塞㊂这与毛文智等[7]㊁李琳等[8]的研究结果相似,表明GPV 感染是造成此次雏鹅发生死亡的重要原因㊂GPV 基因组大小约为5kb,包含2个ORF,左侧ORF 编码非结构蛋白NS,右侧ORF 编码结构蛋31㊀第7期刘宝山等:1株鹅细小病毒的分离鉴定及致病特性㊁VP基因特征分析白VP,VP基因包含VP1㊁VP2㊁VP3等3个ORF,VP1包含VP2㊁VP3,他们使用同一终止密码子;NS主要参与DNA复制和转录的调节,还与病毒的增殖有关;VP蛋白是GPV的主要免疫保护性抗原,与病毒毒力和病毒致病性有关[9]㊂为进一步了解分离毒株HB株的基因变异情况,本研究采用PCR方法对HB株VP基因进行扩增㊂将测序结果拼接后得到VP片段长度为2475bp,包含VP1㊁VP2㊁VP3等3个ORF,其大小分别为2199㊁1764㊁1605bp㊂将VP 基因与国内外的GPV毒株进行比对,结果显示分离到的HB株GPV与5株国内分离毒株同处于遗传进化树Ⅰb群(亚洲群);匈牙利㊁法国等地流行毒株同处于Ⅰa群(欧洲群);Ⅱ群则主要是疫苗毒株㊂由此可见,HB株与GPV国内分离株VP基因之间差异较小,而与国外分离株结构基因的差异相对较大㊂这与孔宪刚等[10]对中国分离株HG5/82株VP 基因的分子特征分析结果相同㊂本研究将以上毒株进行了氨基酸序列分析发现,HB株与GPV各毒株VP基因编码氨基酸相似性在96.6%~99.7%,其中与国内SHFX1201㊁Y株的氨基酸相似性最高,达99.7%,表明其VP同源性较高,这与遗传进化分析结果一致,即目前存在的GPV分离株的遗传关系较近[11-13]㊂刘中勇等[14]对7株鹅细小病毒进行了克隆扩增并将其与标准毒株B株进行比对,发现目前国内的GPV相似性较高,但强弱毒株之间存在一些差异,以上结果也验证了GPV只有1个血清型的观点[11-12,15]㊂GPV与MDPV同属于细小病毒属,两者在病毒大小㊁形态结构㊁理化特征及免疫学特性上极为相似[2,16]㊂程由铨等[17]发现,GPV与MDPV在血清学检测时不发生交叉反应,推测两者在抗原性上存在差异㊂因此,研究GPV与MDPV核苷酸和推导氨基酸序列的差异性,可为进一步研究两者抗原性差异和宿主感染范围提供基础㊂本研究将分离的HB 株与3株MDPV进行遗传进化分析和推导氨基酸序列分析,结果显示,VP基因遗传进化树分为GPV 和MDPV2支,HB株与MDPV毒株氨基酸差异较大㊂以上结果表明,GPV与MDPV之间存在较近的遗传关系,两者可能是由同一种病毒在不同宿主体内长期适应的结果㊂经过病毒分离鉴定㊁致病性研究和VP基因扩增,可确定此次承德白鹅的死亡是由GPV感染造成的㊂本研究对分离毒株的VP基因进行分子特征分析发现,分离到的HB株与其他GPV毒株遗传关系较近,证实GPV只有1个血清型㊂参考文献:[1]㊀殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,1997:1165-1168.YIN Z,LIU J H.Animal virology[M].2nd ed.Beijing:Science Press,1997:1165-1168.[2]㊀ZÁDORI Z,ERDEI J,NAGY J,et al.Characteristics ofthe genome of goose parvovirus[J].Avian Pathology,1994,23(2):359-364.[3]㊀方定一. 小鹅瘟 的介绍[J].中国畜牧兽医,1962(8):19-20.FANG D Y.Introduction of little goose plague [J].China Animal Husbandry&Veterinary Medicine,1962(8):19-20.[4]㊀赵彦超,李祥龙,汪肖媛,等.承德白鹅的养殖现状及发展对策[J].北方牧业,2018(12):9.ZHAO Y C,LI X L,WANG X Y,et al.The breeding sta-tus and development countermeasures of Chengde whitegoose[J].Northern Animal Husbandry,2018(12):9.[5]㊀吴宝玉,马立超,谷雪芬,等.承德白鹅[J].中国畜禽种业,2006(3):56.WU B Y,MA L C,GU X F,et al.Chengde white goose[J].The Chinese Livestock and Poultry Breeding,2006(3):56.[6]㊀李清.小鹅瘟病毒强毒株细胞适应毒的培育及其VP3基因的表达[D].扬州:扬州大学,2007.LI Q.Cultivation of 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荧光定量PCR检测雏鹅人工感染鹅细小病毒后病毒在体内分布规律毕建敏;田夫林;李延鹏;朱瑞良【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2008(030)001【摘要】2005年从山东某鹅场16日龄商品代病死鹅中分离到1株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为SD2005株.用建立的荧光定量PCR(FQ-PCR)检测鹅细小病毒的方法,检测SD2005株人工感染3日龄雏鹅(GPV抗体阴性)后各器官不同时间段的病毒含量,结果表明:在攻毒8 h后能从消化系统及血液、心脏和肝脏中检测到病毒DNA;病毒DNA的含量在48 h后达到最高峰,并一直维持到168 h.随后各待检脏器中病毒DNA含量持续降低,但在720 h后仍能从粪便、肝脏和脾中检测到少量的病毒DNA.本试验为阐明GPV的致病机理及防控提供了重要的试验数据和理论依据.【总页数】4页(P64-67)【作者】毕建敏;田夫林;李延鹏;朱瑞良【作者单位】山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271000;山东省畜牧兽医总站,检验技术中心,山东,济南,250022;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271000;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271000【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2【相关文献】1.鹅细小病毒感染雏鹅的免疫球蛋白IgG/IgM变异性研究 [J], 朱新产;邵艳红;朱峰伟;杨丽金2.感染鹅细小病毒后雏鹅组织器官的3种消化酶及同工酶 [J], 朱新产;韩彬;杨丽金3.鹅细小病毒感染雏鹅的主要组织相容性复合体变异性研究 [J], 朱新产;毕经帅;杨丽金4.鹅细小病毒感染雏鹅血液的蛋白/酶活性及同工酶变异性研究 [J], 朱新产;王倩文;朱峰伟;李洪强5.人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化 [J], 程安春;汪铭书;周毅;陈孝跃;郭宇飞;刘兆宇;方鹏飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。