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三聚氰氨事件溯源，真蛋白检测的缺失三聚氰胺（Melamine）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料，可用于塑料及涂料工业，也可作纺织物防摺、防缩处理剂，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。
2008年，三鹿奶粉添加三聚氰胺事件爆发，一种主要用于工业，并且具有毒性的物资为何会出现在奶粉食品中呢？如何从根本上防止此类现象在中国再次发生，是我们企业、学术、科技届和政府都必须要思考的一个课题。
传统蛋白质检测方法是凯式定氮法，这种方法检测蛋白质是间接法，先测总氮含量，根据总氮含量再计算出蛋白质含量，而非直接测定蛋白含量。
在奶源紧张遭抢购、原料奶粉暴涨近一倍的情况下，一些不法厂商就利用这个检测漏洞，加入高含氮量的三聚氰胺，骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质含量，造成蛋白质检测值虚高，来蒙混过关。
蛋白质检测方法的缺陷导致了致命的造假。
检测蛋白质含量的传统和现行标准方法依然是凯式定氮法和杜马斯燃烧定氮法，即还原无机氮或单质氮，用还原后无机氮或单质氮元素含量表征氨基酸，并反推蛋白质含量。
如果有人就把无机氮加到系统中去，干扰反推法检测蛋白质的含量，因为含氮量的提高有助于蛋白质含量反推结果的提高，会导致蛋白质含量的虚高。
1.凯氏定氮仪：这种方法是Mr. Johan Kjeldahl在1883年发明的。
凯氏定氮法，即采用化学方法，样品消解后含氮化合物转化成氨气，被吸收后经滴定后，测定出总氮元素含量，后经换算转化成蛋白质含量，由于不同的氨基酸序列，凯氏定氮法需要许多不同的校正因子。
并且需要使用浓硫酸和较长时间的加热。
所以造成了凯氏定氮法只能粗略的测量总蛋白质含量。
更致命的缺陷是，测总氮指标后再换算成蛋白指标，造成非蛋白氮会干扰测定的漏洞和机会。
2.杜马斯燃烧定氮法：样品经完全燃烧后转变为氮气，后经测定出的总氮含量后转化为蛋白质含量，步骤是：燃烧→还原→净化→检测，问题依然在于只测总氮指标后再换算成蛋白指标，非蛋白氮会干扰测定，造成蛋白含量值虚高。
HPLC-MS/MS 测定三聚氰胺的实验指导1实验目的和意义：了解并初步掌握高效液相色谱-串联四级杆质谱仪的基本原理与构造；了解高效液相色谱-串联四级杆质谱仪的工作原理和使用范围；学习高效液相色谱法分离化合物和质谱检测化合物含量的方法；通过测定对样品进行定性、定量测定，初步掌握获得色谱质谱图和数据的一般操作程序与技术；学习样品制备的方法；了解影响分析测定的重要因素，学会优化分析条件；学习谱图和数据的处理方法。
通过学习高效液相色谱-串联四级杆质谱仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。
培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。
2.实验原理高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两相间进行反复多次（103-106）的分配（吸附－脱附－放出）由于固定相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。
当高效液相色谱与质谱连接时，质谱相对色谱就是检测器。
质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。
按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定磁场（单聚焦及双聚焦质谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质谱仪）。
MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。
3.实验设备高效液相色谱-串联四级杆质谱仪、色谱柱、容量瓶、分析实验室常用玻璃仪器、乙腈等色谱纯试剂，超纯水，滤膜。
牛奶中三聚氰胺的测定一、实验目的1.通过是一学期的仪器分析实验的学习，尝试自己运用于实际检测中。
2.学习如何处理实际样品以及检测。
3.通过查找文献，如何筛选自己适用的方法。
4.锻炼自己处理和解决新问题的能力。
二、背景简介三聚氰胺（2,4,6 - 三氨基-1,3,5 - 三嗪，C3H6N6）最常见的富含氮的白色晶体的有机物。
主要用于合成三聚氰胺甲醛树脂，制造层压板，塑料，涂料，胶水粘合剂，餐具，厨具。
2007年兽医科学家们证实，宠物食品因含有三聚氰胺导致数以百计的宠物死亡，涉及三聚氰胺的宠物食品在美国和加拿大被召回，之后三聚氰胺便成为一个讨论的话题。
另外还发现在一些谷物宠物食品配料中，有故意掺入三聚氰胺以提高总氮含量的现象。
摄入三聚氰胺可能导致肾结石、肾功能衰竭和其他健康问题。
据2008年的报道，中国婴幼儿配方奶粉发现高浓度的三聚氰胺。
由于食用三聚氰胺污染的婴幼儿配方奶粉和相关的乳制品出现肾管堵塞或肾结石，超过51900婴儿和幼童因泌尿问题（肾管堵塞、肾结石，）住进了医院，导致婴儿6死亡。
不久后，三聚氰胺被发现在液体奶和酸奶，冰冻甜品，奶粉，谷物制品，糖果，糕点，饼干，蛋白粉，和一些加工食品。
因此为了保障大家的身体健康，食品中三聚氰胺的检测越来越引起人们的关注。
三、仪器和试剂三聚氰胺（纯度99％）（购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州））乙腈HPLC级（Merck（德国达姆施塔特））超纯水（通过微孔系统（Millipore公司，Molfheim，法国））针头式过滤器（Chromafil外加PVDF-45/25孔径0.45微米，膜直径25毫米）超声波浴（Bandelin Sonorex，柏林，德国）离心机（Beckman Coulter公司，德国克雷菲尔德）高效液相色谱仪（岛津制作所，日本东京）（实验条件如表1.）表1. 乳制品中三聚氰胺高效液相色谱分析条件仪器岛津LC-20A系统（岛津制作所，日本东京）色谱柱Nucleosil120-3 C8柱;4.6毫米（内径）×250毫米（长），3微米（马歇雷内格尔，杜伦，德国）流动相A=10mmol / L的柠檬酸钠缓冲液含10mmol / L的L-辛烷磺酸钠（pH值3.1），B=乙腈; A /B =85/15(V/)流速 1.0 mL/分钟柱温40℃检测器SPD-M20A二极管阵列紫外- 可见分光光度检测器（岛津制作所，日本东京）检测波长240 nm四、实验步骤⑴按照操作说明书使色谱仪正常运行，并将实验条件调节如下：柱温40℃；流动相流量为1.0ml/min；检测器工作波长240nm。
三聚氰胺检测方法检测方法利用酶联免疫吸附测定法用食品及饲料中三聚氰胺的定量测定。
检测原理酶联免疫吸附测定法定量测定三聚氰胺残留。
利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。
先将三聚氰胺酶标记物，样品萃取物及标准加入到已经包被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。
在30分钟的孵育过程中，样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，孵育30分钟后洗掉小孔中所有没有结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。
在用去离子水清洗结束后，每孔中加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。
孵育30分钟后停止此反应，根据各孔颜色深浅进行数据读取。
依据标准的颜色得出样品中三聚氰胺的的浓度值。
实验所需设备及材料三聚氰胺检测试剂盒（目前常用进口试剂有美国Abraxis公司和美国Beacon公司的）酶标仪一台（配有450nm滤光片）1－5ml可调移液器100－1000ul可调移液器.20－200ul可调移液器.蒸馏水或去离子水..可吸取50ul的移液器及吸头.可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸头.吸水纸或相当的吸水材料.450nm的酶标仪.计时器.洗瓶混旋器.20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸馏水定容至1000ml.注意事项最好配套使用试剂，不要同其它公司的产品混用，不要将不同批次的产品混用。
样品稀释或含有杂质很可能对结果的准确性有影响。
不要使用过期的产品。
使用之前将所有试剂回升至室温，但不要放置超过24小时。
三聚氰胺属于有毒性的化学品，请小心处理。
停止液是1N盐酸，避免接触皮肤。
样品制备（以美国Beacon试剂为例）湿的宠物食品萃取方法（稀释倍数：100）均质样品至布丁状。
称取2g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并剧烈振荡。
超声萃取1分钟。
漩涡混合1分钟，然后静置5分钟，使样品分层。
饲料中三聚氰胺的检测方法三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料，在饲料工业中作为粘合剂使用。
目前国际上通常采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白质的含量。
即求出氮的含量，再乘以一定的换算系数(通常用6．25系数计算)得出蛋白质含量。
由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，每个三聚氰胺分子中都含有6个氮原子，而在原料的粗蛋白检测过程中，用浓硫酸消化过程可以将三聚氰胺分解掉．但在最后的计算中，三聚氰胺中的氮原子即可提高粗蛋白的比率，造成蛋白含量虚假增高。
因此只要在饲料中添加一些含氮量高的化学物质，就可在检测中造成蛋白质含量达标的假象。
饲料中非法添加化工原料．可以提高蛋白质检测数值，而用全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质含量时根本不能区分这种伪蛋白氮。
在饲料中少量添加三聚氰胺即可大大提高蛋白含量。
l三聚氰胺的性质1．1物理性质分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126．12,为纯白色单斜棱晶体，无味，低毒，密度1．573 g ／cm3〔16℃〕。
常压熔点354℃(分解)；快速加热升华，升华温度300℃。
溶于热水，微溶于冷水，极易溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。
在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。
1．2化学性质三聚氰胺的水溶液呈弱碱性(pKb=8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。
在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性环境中(pH值5．5-6．5)与羟甲基的衍生物进展缩聚反响而生成树脂产物。
在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。
三聚氰胺与醛类反响生成加成化合物，其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反响是最重要的反响。
2饲料中三聚氰胺的检测方法2．1试剂盒检测法fELISAl利用萃取液通过均质与震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进展免疫测定。
2010级化学教育仪器化学综合性与设计性实验—高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量——2012-06-03一、实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）二、摘要、关键词：[摘要]三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。
它是白色单斜晶体,为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取,离心, 结合高效液相色谱进行样品测定。
A液：0.9508 g辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。
色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm）,检测波长：240nm。
[关键词] 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品三、引言1、对三聚氰胺的概述：三聚氰胺(Melamine) (化学式:C3H6N6 ) ,俗称密胺、蛋白精,国际纯粹与应用化学联合会命名为「1 ,3 ,5 - 三嗪- 2 ,4 ,6 - 三氨基」,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。
它是白色单斜晶体,几乎无味,微溶于水(311g/PL常温) ,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等,对身体有害,不可用于食品加工或食品添加物。
三聚氰胺的结构式如下：三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF) 的原料。
三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。
该树脂硬度比脲醛树脂高, 不易燃,耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀,有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度,广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。
蛋白质主要由氨基酸组成。
蛋白质平均含氮量为16 %左右,而三聚氰胺的含氮量为66 %左右。
通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过检测含氮量来估算蛋白质含量,因此,添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高,从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。
MARS-HPLC测定不同基质中的三聚氰胺摘要：MARS(Multi-adsorption Reverse SPE) 样品前处理方法是一种快速、简便、安全、成本低廉的样品前处理分析方法，将该方法用于奶制品、鸡蛋和鱼肉等不同样本中的三聚氰胺的提取，主要步骤是使用0.1M的盐酸、6%的磺基水杨酸和混合型阴离子交换树脂（Cleanert PAX）在离心管中同时进行蛋白沉淀和基质分散固相萃取，取离心上清液过滤后用于HPLC测定。
本文对MARS方法用于不同样品前处理的稳定性和可靠性进行了分析和评价，结果表明MARS-HPLC方法用于不同样品中三聚氰胺的检测具有简便、快捷、准确的优点，适合大批量样品的测定。
关键词：三聚氰胺；MARS；混合型阴离子交换树脂；强阳离子交换色谱柱1 实验部分1.1 仪器与试剂仪器：L6-1 系列高效液相色谱仪（北京普析通用公司），三聚氰胺检测样品前处理方法包：（包括盐酸0.1 mol/L，6% 磺基水杨酸，混合型阴离子交换填料Cleanert PAX，（北京艾杰尔科技XXX）；Venusil SCX-M，5μm,4.6×250mm 强阳离子交换色谱柱（科技部“十一五”国家支撑计划成果，北京艾杰尔科技XXX）及保护柱；针式过滤器（Agela Clarify，0.22/0.45µm，尼龙）；三聚氰胺标准品（>99%），均质器（T25 Basic，IKA）。
试剂：所用乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。
1.2 色谱条件色谱柱：Venusil SCX-M色谱柱，4.6×250mm,5μm,300 Å；（科技部“十一五”国家支撑计划成果，北京艾杰尔科技XXX）；流动相：磷酸二氢钾（0.050mol/L）：乙腈=70：30；流速：1.5mL/min；柱温：室温；波长：240 nm；实验中若非特别注明，进样量均为20μL。
1.3 三聚氰胺标准曲线工作液的配制1.3.1 三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103 mg/L。
重量法、电位滴定法、高效液相色谱法、气相色谱－质谱联用法、液相色谱－质谱联用法、毛细管电泳法、近红外线吸收法、比色法、免疫学法1.1重量法：苦味酸法和升华法。
苦味酸法的原理是将三聚氰胺样品用水溶解，再向该溶液中加入苦味酸使其与三聚氰胺生成沉淀，根据生成沉淀的量计算出样品中三聚氰胺的含量。
升华法的原理是将样品置于升华装置中，使样品中三聚氰胺受热升华，准确称取剩余固体的质量。
这两种方法用于工业上检测三聚氰胺的含量准确度相对较高，但分析时间都比较长，操作繁琐，不适合高效快速检测。
1.2电位滴定法电位滴定法在工业中检测三聚氰胺较重量法简单，实验时间较短，但准确度不高。
其实验原理：以硫酸标准溶液滴定含有三聚氰胺的溶液，通过公式用等当量点时消耗硫酸标准溶液的体积计算出三聚氰胺的含量。
不用于食品。
1. 3 高效液相色谱法（HPLC）用HPLC 检测三聚氰胺含量，检出限低，准确度相对较高，可用于食品中三聚氰胺的检测。
实验的一般操作步骤是：用沉淀法先将奶粉中的蛋白质沉淀，然后提取奶粉中的三聚氰胺，将提取液用阳离子交换固相萃取柱净化，最后用高效液相色谱进行检测，外标法定量。
1. 4气相色谱法和质谱联用法（GC-MS）与HPLC 法比较，GC-MS 具有准确度高、检出限低（0.05 mg/kg），更适合食品中三聚氰胺的微量检测。
该方法样品经蛋白沉淀离心后过MCX 固相萃取柱净化、氮气吹干、硅烷化衍生, 再由气相色谱－质谱联用仪检测。
由于三聚氰胺为强极性化合物，难汽化，直接对其进行GC-MS 测定不但灵敏度低且峰拖尾严重，为此王征采用N，O- 双三甲基硅基三氟乙酰胺衍生化，极性的减弱使其容易进行汽化，有利于待测物和基质的分离,降低了背景化学噪音的影响。
王立媛等用GC-MS 方法检测奶粉和鲜奶中三聚氰胺的加标回收率在82.3%～110.0%之间，相对标准偏差（RSD）＜10%，方法净化效果好、准确度高、灵敏度好。
但是GC- MS 法需要进行衍生化, 样品处理步骤复杂,不适用于多杂质生物检材中三聚氰胺的快速筛查和定量分析。
