设计RTPCR引物方法

标准终点RTPCR

实时荧光定量PCR（real-time PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、遗传疾病诊断等领域。在实时荧光定量PCR技术中，终点PCR是一种常用的PCR方法，它可以通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。本文将介绍标准终点RTPCR的原理、方法和应用。

1. 原理。

标准终点RTPCR是一种半定量PCR技术，其原理是利用DNA或RNA模板，在PCR反应体系中进行多轮扩增，通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。在PCR反应中，每一轮循环都会产生指数级增加的DNA或RNA产物，同时伴随着荧光信号的累积。当PCR反应达到饱和时，荧光信号会呈指数级增加，最终趋于平稳。通过检测PCR反应终点的荧光信号强度，可以确定起始模板的含量，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。

2. 方法。

标准终点RTPCR的方法包括PCR反应体系的准备、PCR程序的设置、荧光信号的检测和数据分析等步骤。首先，需要准备PCR反应体系，包括模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶等。然后，设置PCR程序，包括预变性、PCR扩增和荧光信号采集等步骤。在PCR扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的累积而增加，直至达到饱和。最后，通过荧光检测仪器采集PCR反应终点的荧光信号，并进行数据分析，得出目标DNA或RNA的定量结果。

3. 应用。

标准终点RTPCR技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。在基因表达分析中，可以利用标准终点RTPCR技术对特定基因的表达水平进行定量分析，从而揭示基因调控网络和信号转导通路。在病原微生物检测中，可以利用标准终点RTPCR技术对病原微生物的核酸进行定量检测，实现对病原微生物的快速、准确的诊断。在遗传疾病诊断中，可以利用标准终点RTPCR技术对患者的遗传物质进行定量分析，为临床诊断和治疗提供依据。

PCR引物设计

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：

① 引物长度

一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火温度

退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④ 避免扩增模板的二级结构区域

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

RTPCR原理和实验步骤

1 / 8 RT—PCR原理与实验步骤

一、知识背景：

1、基因表达：DNA RNA Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A。变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；

B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合.

C。延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’ 3’方向延伸。

以上三步为一个循环,如此反复。

3、逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链;

2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA；

3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。

二、RT—PCR的准备:

1。引物的设计及其原则：

1） 引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。