PCR引物设计详细步骤

引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延

伸的出发点而起作用的多核苷酸链。

引物设计原理及详细步骤：

1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同

一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列

就是该基因的保守区。

2、引物长度一般在15-30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延

伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，

即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4、引物3'端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并

，会影响扩增的特异性与效率。

5、引物3'端不能选择A，最好选择T。

引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在

错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，

G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。

6、碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致

错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的 分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C

PCR引物设计要点

1. 书写规则

设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）；

2. 引物长度

一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好；

3. GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大；

4. 退火温度

可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；

一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下，但一般不要1℃ 1℃升，或1℃ 1℃降，因为这样效果不大；

5. 避免与靶DNA的错配

引物要具有特异性，与非特异扩增序列的同源性不应超过70%或有连续8个互补碱基同源，可针对基因组BLAST检测，看是否能错配到其它非特异顺序上；

6. 避免引物及模版的二级结构区域

引物自身避免有连续4个碱基的互补，若不能避开这一区域时，可尝试7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP。若有可能，也应尽量避免扩增含稳定二级结构的目的片段(可用软件估计，一般待扩区域自由能△G小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功)；

7. 避免引物二聚体

引物之间避免有连续4个碱基的互补以免形成二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；

酸谈实验室

众妙书院

辅修课

课堂笔记

02 基因表达检测：PCR引物设计

主讲人 猫大

酸谈实验室课堂笔记02 1

第2颗

基因表达检测:PCR引物设计

回顾——rtPCR原理：

P.S. 引物-模板接头是PCR反应的重要底物

引物设计流程：

找到目的基因CDS序列的保守区域

用软件设计引物

用软件评价引物

Blast引物特异性

引物设计软件：OLIGO

序列比对软件：DNAMANRNA

cDNAreverse

transcription

94℃

Denaturation

3’5’

68℃~72℃RNA抽提？

反转录

引物?PCR程序

PCR酶

PCR体系PCR产物检测

Annealing

3’5’5’3’55℃~72℃

PrimerExtension

3’5’5’3’

Taq

猫大同款软件1

猫大同款软件2

酸谈实验室课堂笔记02 2

引物设计操作：

1、找模板序列：方法1) NCBI Nuciotide transcript （人） CDs 保存seq文件

方法2) NCBI Gene（任意物种） Refseq RNA

transcript CDs 保存seq文件

2、找CDs保守区域：DNAMAN Sequence Alignment

Multiple Sequence Alignment File打开seq文件

下一步×3，完成 取白底黑字序列保存或贴到OLIGO里

3、设计引物：OLIGO Change Current Oligo Length修改引物长度

Tm框里搜索合适引物，用Upper和Lower选定

4、评价引物：Analyze PCR

5、保存引物：Edit Ctrl+C，Ctrl+V贴到excel表里

p.s.软件相关提示

这里不要出现字！

这里不要出现字！

这里不要出现字！

酸谈实验室课堂笔记02

3 软件可能出现的一些提示及应对措施：

引物间有二聚体，随意挑一条引物挪动几个碱基；

PCR引物的设计原则：

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧ 引物5′端可以修饰。

⑨ 引物3′端不可修饰。

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为18~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.碱基随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身