分子克隆实验步骤总结
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分子克隆实验步骤
1.对目的片段进行pcr扩增:
Pcr体系:(50µL)
DNA Template:10-100ng
10×PCR buffer:5µL
50mM dNTPs:0.5µL
Primers:1µM each
Water:add to 49µL
Taq Polymerase:1µL
2.琼脂糖电泳,看有无目的条带
3.对目的条带进行切胶回收
4.对pcr产物加尾: 72℃,20min(如用高保真酶,则需加尾;Taq酶,则无需加尾)
加尾体系:(10µL)
胶回收DNA: 8µL
Buffer: 1µL
dNTPmix: 0.5µL
Taq Polymerase:0.5µL
5.T载体连接:室温,30min
体系:(6µL)
加尾后产物:4µL
T载体:1µL
Salt solution 1µL
6.30-40µL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s(放冰上冷:1-2min)
9. 加SOC(200-250µL)
10.37℃,300rpm,1h
11.平板涂布:加氨苄的培养基,37℃培养箱倒置培养过夜
12.挑单菌落:用牙签挑单菌落,放到含6mL液体培养基的试管中,
37℃摇床培养过夜
13.试剂盒提质粒
14.酶切:37℃,2h
体系:(20µL)
Buffer2: 2µL
酶:0.5µL
模板:1µL
BSA:0.2µL
H2O:16.31µL
15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段
鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR
从平板挑单菌落到含1ml LB(Amp+)的1.5drof管中,37℃摇床培养8小时左右,进行菌落PCR鉴定,引物可选用载体的通用引物,如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系(20ul)10*taq buf 2ul
dNTPs(2.5mM)1.6ul Mg2+(25mM)1.6ul Primer F(10uM)0.5ul Primer R(10uM)0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul
ddH2O 12.5ul
程序:
94度10min
94度30sec
56度30sec
72度2:10 30cycle 72度10min
4度forever