动物细胞与组织培养
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细胞培养的缺点 现在人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相 同。 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 时间久了，必然发生变化
体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一，
缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现
抗原决定簇---抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段
多克隆抗体----一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个 B 淋巴细胞产生 相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多 克隆抗体
杂交瘤细胞---将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的
人抗鼠抗体（HAMA）反应----鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系 统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体
血清的缺点 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，可能改变某种细胞在体内的
正常状态 血清含一些对细胞产生毒性的物质 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠 性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产 中分离纯化工作很难完成。 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部 分之一
体外培养细胞生存所需基本物质 （一）糖 （二）氨基酸 （三）维生素 （四）促生长因子 （五）其它物质
细胞培养的常用液体 水 平衡盐溶液---由无机盐、葡萄糖组成，维持细胞渗透压平衡，保持 pH 稳定及提供简单的营 养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 消化液---进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴 壁细胞从瓶壁上消化下来。胰酶溶液和 EDTA 溶液，胶原酶溶液 消化酶抑制剂----血清，大豆胰蛋白酶抑制剂 pH 调整液----NaHCO3 溶液，HEPES 溶液 抗生素液---青霉素，链霉素 谷氨酰胺补充液----（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
贴附生长型细胞在体内、外粘附方式存在差异
体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征。
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同
贴附生长型根据粘附生长时形态的不同，主要分为 4 类： 1.上皮细胞型： 仅形态上似体内，类似体内的上皮细胞 来源于外胚层、内胚层细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核 易相连成片 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动
（2）过多的追加 L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平
培养基-----细胞的生长需要一定的营养环境，用于维动物体液或利用组织分离提取的一类培养基
血清的主要作用 提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 对培养中的细胞起到某些保护作用---抗蛋白酶
4.多形型细胞 有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定他们规律和稳定的形态，都归入多形细 胞型。
悬浮生长型--- 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持在悬浮状态下 生长 特点：在悬浮条件下生长良好
细胞圆形，单个或小细胞团 优点
生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点
细胞分裂活动 （即增殖活性）的衡量指标 有丝分裂指数---指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比 细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间
体外培养细胞的遗传学特征 （一）核型变化 （二）永生化和恶变 （三）细胞性别
体外培养细胞的生存环境 （一）无污染环境 （二）温度 （三）气体环境和氢离子浓度
接种的细胞密度越大，数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。
2.指数增生期----是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数量呈指数增长。 细胞群体均一，理想的实验用细胞。
3.停滞期----虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累，pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则脱落死亡，故传代 应越早越好
细胞培养技术的优点 1.研究的对象是活细胞:在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检 测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。 2. 研究条件可以人为控制 3. 研究的样本可以达到比较的均一 4. 研究内容便于观察、检测和记录 5.研究的范围比较广泛 6.研究的费用相对较经济
细胞株---从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增 殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦 可称之为亚株
贴壁细胞的冻存 酶解贴壁细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。 在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。 以大约 1000 rpm 离心 5 分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 以 5×106 到 1×107 细胞/ml 密度，在冻存液中悬浮细胞。 分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入 4℃冰箱中１小时。
观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
正常动物细胞培养的典型特征 核型（染色体）正常，表明没有明显的基因改变。
细胞的传代次数大约在 50 代左右，有限的寿命反应了细胞的生长调节。 细胞无恶性，表现在将该细胞注入免疫抑制动物不能形成肿瘤。 贴壁依赖、接触抑制和密度抑制表明其增殖受到抑制，当细胞在介质表面生长至汇合单层时 增殖就停止。
传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容 器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更 新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代 特点： 在整个生命期中此期的持续时间最长，整个培养过程的主要时期。 细胞增殖旺盛，细胞生长活跃，并能维持二倍体核型。
培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，包括原代培养期、传代培养期 及衰退期三个阶段
原代培养期---也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续 1-4 周 特点： 1，细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。 2，与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。 3，细胞独立生存性差。 4，初代培养的细胞多呈二倍体核型。
为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化，改造方法 原因：血清半衰期短，20h 抗原抗体结合力、亲和力不够 募集效应细胞产生副作用 HAMA 反应：8－10 天出现，20－30 天高峰, 加速单抗清除。 过敏休克 人源性单克隆抗体的制备 细胞工程单克隆抗体技术 1 人-鼠杂交瘤单克隆抗体----人脾细胞＋鼠骨髓瘤细胞 2 人-人杂交瘤单克隆抗体----人脾细胞＋人骨髓瘤细胞 3 EB 病毒转化-融合技术------利用 EB 病毒转化 B 淋巴细胞为永生细胞
细胞以 1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到 -70℃到-90℃的冰箱中过夜，然后转移到液氮中长期贮存
悬浮细胞的冻存 计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约 1000 rpm 离心 5 分钟沉淀细胞， 使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 以５×106 到 5×107 细胞/ml 密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞。 分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入 4℃冰箱中，5 分钟内开始冷冻步骤。 细胞以 1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到 -70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
2.成纤维细胞型 凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 由中胚层间充质组织起源的组织 胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出 2—3 个长短不等的突起，中间有卵圆形核 排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动。
游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起
3.游走细胞型 伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动。 形状不稳定。单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细
失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化
培养细胞的分化 1．不适应 2．脱分化或去分化
体外细胞培养物的生长类型 按生长方式: 2 种类型 粘附型(贴壁型)细胞: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。大多数细胞 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。某些肿瘤细胞 和白细胞可在悬浮状态下生长。
单层细胞培养 悬浮细胞培养 注意事项 分离组织： 使用锋利的刀具，减少对组织的损伤。 在取材时除去脂肪和坏死组织。 离心转速要适度。 消化及接种： 选取合适的消化酶，消化的时间因组织而异，一般为 30 min。 接种的密度应比传代培养大——选择营养丰富的培养基和血清
克隆培养法---指单细胞培养，使之无性繁殖获得克隆细胞株的方法
血清的使用 大部分血清在使用前必须灭活处理，即 56℃30 分钟。灭活的目的是灭活血清中的补体和支 原体。
基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
原代培养 1 取材组织: 2 组织细胞的分离：机械法：离心、切割分离、机械分散法
消化法：胰酶、EDTA、胶原酶 3 培养方法：组织块培养法
冻存细胞的复苏 冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细 胞对冻存剂（DMSO 或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中
细胞融合一般是指用人工的方法，即利用电流或各种融合剂，把两个邻接的细胞界膜溶解掉， 使二个或二个以上的细胞合并成一个细胞
融合细胞的特征 (一)它具有接近双亲细胞的全套染色体组，含有四倍体或多倍体，但这种杂交细胞的染色体 组是不稳定的，尤其是种间杂交细胞更不稳定 (二)融合细胞的表现形式多种多样，一方面固然是由于制备融合细胞时可以按照人们的意志 组合使产生多样性，另一方面确实也是由于这种杂交细胞的遗传不稳定性引起的 (三)融合细胞中两个亲本具有遗传互补作用
体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一，
缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现
抗原决定簇---抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段
多克隆抗体----一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个 B 淋巴细胞产生 相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多 克隆抗体
杂交瘤细胞---将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的
人抗鼠抗体（HAMA）反应----鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系 统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体
血清的缺点 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，可能改变某种细胞在体内的
正常状态 血清含一些对细胞产生毒性的物质 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠 性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产 中分离纯化工作很难完成。 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部 分之一
体外培养细胞生存所需基本物质 （一）糖 （二）氨基酸 （三）维生素 （四）促生长因子 （五）其它物质
细胞培养的常用液体 水 平衡盐溶液---由无机盐、葡萄糖组成，维持细胞渗透压平衡，保持 pH 稳定及提供简单的营 养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 消化液---进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴 壁细胞从瓶壁上消化下来。胰酶溶液和 EDTA 溶液，胶原酶溶液 消化酶抑制剂----血清，大豆胰蛋白酶抑制剂 pH 调整液----NaHCO3 溶液，HEPES 溶液 抗生素液---青霉素，链霉素 谷氨酰胺补充液----（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
贴附生长型细胞在体内、外粘附方式存在差异
体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征。
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同
贴附生长型根据粘附生长时形态的不同，主要分为 4 类： 1.上皮细胞型： 仅形态上似体内，类似体内的上皮细胞 来源于外胚层、内胚层细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核 易相连成片 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动
（2）过多的追加 L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平
培养基-----细胞的生长需要一定的营养环境，用于维动物体液或利用组织分离提取的一类培养基
血清的主要作用 提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 对培养中的细胞起到某些保护作用---抗蛋白酶
4.多形型细胞 有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定他们规律和稳定的形态，都归入多形细 胞型。
悬浮生长型--- 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持在悬浮状态下 生长 特点：在悬浮条件下生长良好
细胞圆形，单个或小细胞团 优点
生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点
细胞分裂活动 （即增殖活性）的衡量指标 有丝分裂指数---指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比 细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间
体外培养细胞的遗传学特征 （一）核型变化 （二）永生化和恶变 （三）细胞性别
体外培养细胞的生存环境 （一）无污染环境 （二）温度 （三）气体环境和氢离子浓度
接种的细胞密度越大，数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。
2.指数增生期----是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数量呈指数增长。 细胞群体均一，理想的实验用细胞。
3.停滞期----虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累，pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则脱落死亡，故传代 应越早越好
细胞培养技术的优点 1.研究的对象是活细胞:在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检 测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。 2. 研究条件可以人为控制 3. 研究的样本可以达到比较的均一 4. 研究内容便于观察、检测和记录 5.研究的范围比较广泛 6.研究的费用相对较经济
细胞株---从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增 殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦 可称之为亚株
贴壁细胞的冻存 酶解贴壁细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。 在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。 以大约 1000 rpm 离心 5 分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 以 5×106 到 1×107 细胞/ml 密度，在冻存液中悬浮细胞。 分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入 4℃冰箱中１小时。
观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
正常动物细胞培养的典型特征 核型（染色体）正常，表明没有明显的基因改变。
细胞的传代次数大约在 50 代左右，有限的寿命反应了细胞的生长调节。 细胞无恶性，表现在将该细胞注入免疫抑制动物不能形成肿瘤。 贴壁依赖、接触抑制和密度抑制表明其增殖受到抑制，当细胞在介质表面生长至汇合单层时 增殖就停止。
传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容 器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更 新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代 特点： 在整个生命期中此期的持续时间最长，整个培养过程的主要时期。 细胞增殖旺盛，细胞生长活跃，并能维持二倍体核型。
培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，包括原代培养期、传代培养期 及衰退期三个阶段
原代培养期---也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续 1-4 周 特点： 1，细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。 2，与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。 3，细胞独立生存性差。 4，初代培养的细胞多呈二倍体核型。
为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化，改造方法 原因：血清半衰期短，20h 抗原抗体结合力、亲和力不够 募集效应细胞产生副作用 HAMA 反应：8－10 天出现，20－30 天高峰, 加速单抗清除。 过敏休克 人源性单克隆抗体的制备 细胞工程单克隆抗体技术 1 人-鼠杂交瘤单克隆抗体----人脾细胞＋鼠骨髓瘤细胞 2 人-人杂交瘤单克隆抗体----人脾细胞＋人骨髓瘤细胞 3 EB 病毒转化-融合技术------利用 EB 病毒转化 B 淋巴细胞为永生细胞
细胞以 1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到 -70℃到-90℃的冰箱中过夜，然后转移到液氮中长期贮存
悬浮细胞的冻存 计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约 1000 rpm 离心 5 分钟沉淀细胞， 使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 以５×106 到 5×107 细胞/ml 密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞。 分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入 4℃冰箱中，5 分钟内开始冷冻步骤。 细胞以 1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到 -70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
2.成纤维细胞型 凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 由中胚层间充质组织起源的组织 胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出 2—3 个长短不等的突起，中间有卵圆形核 排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动。
游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起
3.游走细胞型 伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动。 形状不稳定。单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细
失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化
培养细胞的分化 1．不适应 2．脱分化或去分化
体外细胞培养物的生长类型 按生长方式: 2 种类型 粘附型(贴壁型)细胞: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。大多数细胞 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。某些肿瘤细胞 和白细胞可在悬浮状态下生长。
单层细胞培养 悬浮细胞培养 注意事项 分离组织： 使用锋利的刀具，减少对组织的损伤。 在取材时除去脂肪和坏死组织。 离心转速要适度。 消化及接种： 选取合适的消化酶，消化的时间因组织而异，一般为 30 min。 接种的密度应比传代培养大——选择营养丰富的培养基和血清
克隆培养法---指单细胞培养，使之无性繁殖获得克隆细胞株的方法
血清的使用 大部分血清在使用前必须灭活处理，即 56℃30 分钟。灭活的目的是灭活血清中的补体和支 原体。
基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
原代培养 1 取材组织: 2 组织细胞的分离：机械法：离心、切割分离、机械分散法
消化法：胰酶、EDTA、胶原酶 3 培养方法：组织块培养法
冻存细胞的复苏 冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细 胞对冻存剂（DMSO 或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中
细胞融合一般是指用人工的方法，即利用电流或各种融合剂，把两个邻接的细胞界膜溶解掉， 使二个或二个以上的细胞合并成一个细胞
融合细胞的特征 (一)它具有接近双亲细胞的全套染色体组，含有四倍体或多倍体，但这种杂交细胞的染色体 组是不稳定的，尤其是种间杂交细胞更不稳定 (二)融合细胞的表现形式多种多样，一方面固然是由于制备融合细胞时可以按照人们的意志 组合使产生多样性，另一方面确实也是由于这种杂交细胞的遗传不稳定性引起的 (三)融合细胞中两个亲本具有遗传互补作用
