DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
梳子干净晾干有利于梳孔的形成。
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。
3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。
二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。
瓶子。
因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。
保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。
倒胶时尽量减少气泡的产生。
可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。
梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。
不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。
用枪头赶掉气泡。
高，导致背景太深。
摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。
高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。
4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。
时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。
暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。
电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。
一、实验目的在DNA上以限制性内切酶的酶切位点作为标记所绘制的物理图谱就是限制性内切酶图谱，限制性内切酶图谱与其他相关资料联合使用，可用于基因克隆、分离和基因功能研究。
二、实验原理（一）酶切图谱的构建限制性内切酶在DNA上有特异的识别和切割位点，可将DNA切开而得到两个或两个以上的大小不同的片段，这些片段可通过电泳分离并检测其大小。
双酶切法酶切图谱构建是使用两种不同的限制性内切酶对同一个DNA分子进行单酶切和双酶切，将所得的片段进行对比组装，对交替区域进行加减以确定酶切位点的相对位置。
假如n代表某限制性内切酶在DNA上的酶切位点数，F代表完全酶切后的片段数，则线形DNA单酶切后:F=n+1,而环状DNA单酶切的F=n。
若使用双酶切时，所得的片段中有两类：一是与单酶切片段完全相同的保留片段：二是单酶切片段备再切割后小片段，这些的片段的分子量之和等于单酶切片段的分子量。
将以上片段电泳后，遵循以下“三三”规则进行分析：1、区分三类片段，并做好标记：（1）消失片段Fd(Disppeared fragment)，即单酶切片段经双酶切后消失的片段。
（2）保留片段Fr(Remaiined fragment)，即单酶切片段经双酶切后仍保留的片段。
（3）接头片段Fl(Linker fragment)：即双酶切后出现的新片段，由Fd再切割而来。
2、分析三类片段的关系：（1）两种酶的Fd总数相同，而Fr总数不等。
（2）Fd的片段总数为的1/2。
（3）两种酶Fl的相同。
3、排列三类片段，构建酶切图谱：（1）首尾排列：每种酶Fd的片段的首尾只能接Fl片段。
（2）夹心排列：一种酶的Fr片段只夹于另一种酶的两个Fl片段中间。
（3）镶嵌排列：两种酶的Fd段彼此镶嵌排列，由共同的Fl片段连接。
此外，应注意：①若第一种酶的单酶切片段数为F1，第二种酶切片段数为F2，双酶切的片段数为F，则线形DNA的F=(F1+F2)-1，而环状DNA的F=F1+F2。
