实验荧光显微镜及激光共聚焦显微镜使用

第1篇一、实验目的1. 理解细胞骨架的基本概念及其在细胞生物学中的重要性。

2. 掌握使用荧光显微镜观察细胞骨架的方法和技巧。

3. 认识细胞骨架的主要组成成分，包括微丝、微管和中间纤维。

4. 分析细胞骨架在不同细胞类型和生理状态下的形态和分布。

二、实验原理细胞骨架是真核细胞内由微丝、微管和中间纤维组成的网状结构，负责维持细胞形态、细胞运动、物质运输、信号传导等重要功能。

微丝主要由肌动蛋白组成，微管主要由α-和β-微管蛋白组成，而中间纤维则由多种蛋白质组成。

细胞骨架的结构和动态变化对细胞的正常生理功能至关重要。

三、实验材料与仪器材料：1. 植物细胞样本（如洋葱鳞片叶表皮细胞）2. 动物细胞样本（如小鼠成纤维细胞）3. 荧光标记的细胞骨架蛋白抗体4. 抗荧光标记的抗体5. 胶体金标记的抗体6. 封片剂仪器：1. 荧光显微镜2. 激光共聚焦显微镜3. 冷冻切片机4. 液氮5. 恒温培养箱6. 电子显微镜四、实验步骤1. 样本制备：- 植物细胞样本：取洋葱鳞片叶表皮细胞，用2%的戊二醛固定，进行冷冻切片。

- 动物细胞样本：培养小鼠成纤维细胞，用2%的戊二醛固定，进行冷冻切片。

2. 荧光标记：- 将切片置于含有荧光标记的细胞骨架蛋白抗体的溶液中，室温孵育一段时间。

- 洗涤切片，去除未结合的抗体。

3. 抗荧光标记抗体：- 将切片置于含有抗荧光标记抗体的溶液中，室温孵育一段时间。

- 洗涤切片，去除未结合的抗体。

4. 胶体金标记抗体：- 将切片置于含有胶体金标记抗体的溶液中，室温孵育一段时间。

- 洗涤切片，去除未结合的抗体。

5. 封片：- 将切片置于封片剂中，覆盖玻片，封片。

6. 显微镜观察：- 使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的形态和分布。

五、实验结果与分析1. 洋葱鳞片叶表皮细胞：- 在荧光显微镜下观察到洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架主要由微丝和微管组成。

- 微丝呈网状分布，主要位于细胞质膜内侧。

- 微管呈束状分布，主要位于细胞核周围。

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用开机顺序软件的快速使用说明显微镜的触摸屏控制关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成;系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用开机顺序1打开稳压电源绿色按钮等待2 分钟电压稳定后,再开其它开关2主开关MAIN SWITCH “ON”电脑系统SYSTEMS/PC “ON”扫描硬件系统COMPONENTS “ON”3打开电动显微镜开关打开荧光灯开关注：具有5 档光强调节旋钮4Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟,将激光器扳钮由“Standby”扳至“Laser run”状态,即可正常使用5打开电脑开关,进入操作系统注：键盘上也具有电脑开关软件的快速使用说明1电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标2进入ZEN 界面,弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、分析等;“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已存图像数据的处理、分析;3软件界面：1 功能界面切换：扫描取图Acquisition、图像处理Processing、维护Maintain注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用2 动作按钮；3 工具组多维扫描控制；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示;Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程1组图片,如XYZ、XYT 等;Stop ——暂停/结束扫描;New ——建立一个新图像扫描窗口/文档;激光连接状况检查眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换ZEN软件界面右上角：Ocular ——通过观察筒用眼睛观察;激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛; Camera ——光路切换至相机;LSM ——共聚焦扫描成像光路;显微镜设置：“Ocular”——>“Light Path”——>点击物镜图标,选择物镜——>样品聚焦;透射光控制Transmitted Light Control反射光光闸控制Reflected Light Shutter荧光激发块选择Reflector共聚焦LSM 扫描设置点击“LSM”ZEN软件界面右上角,系统切换至共聚焦扫描光路：光路设置：Smart Setup ——自动预设光路选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法,应用“Apply”;注：Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫描;Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺序扫描;Best compromise 为兼顾速度与信号的折中式扫描;扫描图像参数设置：每个通道的精细调节：包括：1Pinhole的调节一般设为1AU;该值越大,则信号越强,但共聚焦图像效果会降低;原则上, 在保证图像质量的前提下,该值越接近于1AU 越好；2Master Gain的调节增大则信号和噪音都增强,减小则信号和噪音均减小;原则上,在保证图像质量的前提下,Gain值越小越好；3Digital Offset的调节可扣除背景噪音,但标本信号也有一定程度的扣除;原则上,在保证图像质量的前提下,Digital Offset值越接近于0越好；4Digital Gain的调节增大则信号和噪音都增强,减小则信号和噪音均减小;原则上,在保证图像质量的前提下,Gain值越接近于~越好；5另外,对于每个通道,需要灵活调节激光的强度激光强度越高,则信号越强,但噪音也相应增强,同时标本更容易被漂白或淬灭;原则上,在保证图像质量的前提下,激光强度越低越好; 选择可连续扫描、一边预览图像效果、一边精细调节各个通道的扫描参数;如果预览图像的效果可以,则先“Stop” ,再点击“Single” 或“Start”即可完成图像的扫描;图像的保存：三种方法：1“File”菜单下,“Save”或者“Save AS”;2点击右下角按钮;3点击工具栏按钮;如图所示另外,通过“File”菜单下的“Export”,也可将图像以其它格式输出;显微镜的触摸屏控制显微镜可由TFT 液晶触摸屏进行控制：由触摸屏“Home/主页”进入“Control/显微镜控制”界面,触摸屏常用控制界面：TFT触摸屏控制直观、便捷;Objectives物镜控制TL透射光光闸RL反射光光闸Reflector荧光激发块控制荧光观察时,需要选择相应的荧光激发块或者激发波长、发射波长相近的荧光激发块Light path光路设置触摸控制,可将光路切换至“Eyepiece”目镜观察筒,或者将光路切换至左侧共聚焦光路“Sideport L”,或者将光路切换至前侧“Frontport”相机;关机顺序：1关闭软件：主菜单“File”——>“Exit”,退出共聚焦软件ZEN;2关闭主电脑操作系统、显示器电源;3关闭荧光灯电源;4关闭电动显微镜电源;5关闭Ar 激光器：先将扳钮从“Laser run” 扳到“Standby” 状态；再将钥匙逆时针从“—”旋转到“O”状态；等待约8-10分钟、激光器风扇停止转动后切记,将主开关按钮按到“OFF”;6扫描硬件系统COMPONENTS “OFF”电脑系统SYSTEMS/PC “OFF”主开关MAIN SWITCH “OFF”7等灯箱充分冷却后,再放防尘罩;8如果系统长时间超过5个小时不使用,则关闭稳压电源;3 系统的维护主要注意事项如下：1打开稳压电源时,应等待2 分钟电压稳定后,再开其它开关;2严格遵守激光器的开、关流程详见“、开/关机顺序”;3如果使用过油镜,或者物镜表面较脏,则需用擦镜纸擦干净物镜的前表面清洁液使用无水乙醇和无水乙醚的混合液,混合比例：无水乙醇30%、无水乙醚70%;4不使用荧光时,不打开荧光灯;避免频繁开/关荧光灯;5必须等灯箱充分冷却后,再小心地盖上防尘罩;6显微镜可由TFT触摸屏控制,使用触摸屏时注意：①手指保持清洁、干燥状态,并且为了保证他人使用安全,触摸时严禁配戴有可能接触污染物或危险样品的手套；②触摸屏已足够灵敏,不要大力按压触摸屏；③不要旋转、插拔触摸屏;7刻录图像数据资料：应使用刻录光驱刻录,实验前应准备好刻录光盘; 切记：为了防止计算机病毒,严禁在共聚焦电脑上使用U盘、硬动硬盘或者上网8未经授权,严禁自行安装任何软件9实验室温度应保持在22℃±2℃,湿度40%-60%;10避免空调直接对着显微镜吹风;11整个实验过程应注意保持显微镜周围环境清洁;。

激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。

紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。

成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。

分光器将荧光直接送到探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。

两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。

这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。

以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。

由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。

把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。

即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。

基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。

把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。

1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。

1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。

而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。

这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

1．4用计算机采集和处理光号,并利用光电倍增管放大号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。

而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的号放大,灵敏度提高。

由于综合利用了以上技术。

可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。

2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用现在,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够代替以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作良好的经常利用光学显微镜的有机组合,如颠倒光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等,因此被称为万能显微镜,通过它所获得的精密图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)，英⽂简写LSCM，俗称confocal。

LSCM是⼀种⾼科技显微镜，属于最先进的细胞⽣物学分析仪器。

我们学院使⽤的是瑞⼠徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。

使⽤流程1、登陆ftp://10.31.60.139 或5号楼606室公⽤电脑下载《激光共聚焦预约使⽤审核表》，打印并填写。

2、联系卢剑清（⼿机：135********）审核并签名。

3、持已签名的《激光共聚焦预约使⽤审核表》⾄5号楼610室预约使⽤时间，及领取钥匙，联系⼈：窦凯飞（⼿机：152********）。

4、在熟练使⽤者的指导下，进⾏实验。

5、实验结束，及时归还钥匙。

仪器构造和原理LSCM的基本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。

激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采⽤的⾃然光或灯光是⼀种场光源, 标本上每⼀点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的⼲扰。

⽽LSCM 以激光为光源, 激光具有单⾊性强﹑⽅向性好﹑⾼亮度﹑相⼲性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。

⼀般常⽤的⽓体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。

illuminating pinhole（照明针孔）：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源⽅向性强、发散⼩、亮度⾼、⾼度的空间和时间相⼲性以及平⾯偏振激发等独特的优点。

且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平⾯形成共聚焦装置。

分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后, 通过物镜在样品聚焦。

对标本内焦平⾯上的每⼀点进⾏扫描,Focal plane（焦平⾯）：激光点光源照射物体在焦平⾯处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。

实验二生物样品的荧光观察一、实验目的1、初掌握荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的结构、原理、使用方法及其在细胞生物学研究中的应用。

2、掌握生物材料的荧光染色和活体荧光蛋白的观察方法。

3、了解激光共聚焦的原理。

二、实验原理1、某些物质经短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。

其能量除部分转换为热量外，相当一部分则以波长较长的光能辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。

细胞内的某些物质经过短波光照射后，可以发出自发荧光。

在生物学研究中，能将发荧光的有机化合物-荧光染料与特定的细胞组分相结合，通过激发后产生的荧光对细胞组分进行定性和定位。

2、生物样品的荧光观察采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

荧光显微镜以波长较短的光为光源，照射被检样品，激发被检物品内的荧光物质发出可见的荧光，通过物镜和目镜放大成像。

激光共聚焦显微镜也是来观察样品中荧光分布状况的。

激光共聚焦显微镜是以激光为光源，在某一瞬间只用很小一部分光照明，通过检测器的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，而来自焦平面外的散光则被小孔和裂缝挡住，成像异常清晰。

此外，激光共聚焦显微镜可以在同一样品的不同焦平面进行扫描得到不同焦平面的图像，然后通过计算机重构出样品的三维结构。

3、本实验中微丝的荧光观察采用荧光素标记的鬼笔环肽（phalloidin），鬼笔环肽可以专一的结合在聚合状态的肌动蛋白丝上，起到稳定微丝的作用。

细胞核的观察用DAPI（diamidino-2-phenylindole）染色。

DAPI 能与DNA双螺旋的凹槽部分相互作用，从而与DNA双链紧密结合。

结合后产生的荧光基团的吸收峰358nm，而散射峰是461nm。

而植物细胞的花粉管、筛板和胞间连丝含有胼胝质成分，经苯胺蓝染色后，用紫外光激发，可以发出黄绿色荧光。

4、激光共聚焦扫描显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）原理：用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用可以参照相关参考资料
荧光显微镜是一种放大显微镜，它可以用于观察单个细胞或多个细胞，甚至是单个分子。

它的工作原理是，激发光通过荧光技术和特定的滤色片
将被观察物体的荧光分子特定波长的光波吸收，然后通过精密的放大镜头
进行放大，并通过荧光镜板分别输出激发光和发射光，最后将多波长波段
的发射光通过摄像机捕捉，从而形成的荧光图像。

荧光显微镜的优势之一
是它可以用于检查细胞和其内部的结构，可以检测不同的细胞特性，包括
活性、基因型、蛋白质含量和其他蛋白质表达。

激光扫描共聚焦显微镜是一种表面观察技术，它通过光学系统将多束
激光（称为共聚束）聚合到一个点，从而使能量集中到一个空间仅仅几微
米的点上，引起形成激发光，它可以精确地显示表面的形貌、表面缺陷和
细节。

此外，它还可以在极低的功率下，提供精确的材料成分和表面化学
分析，包括成分的化学结构、光谱以及深度分析，同时还能提供室温下的
探针定量分析。

激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。

仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。

1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。

照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。

在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。

激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南目录第一章：Ti-E 显微镜操作2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6Ti-E 物镜，DIC 插片，DIC 棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10 第三章：共聚焦图像拍摄1-38NIS-Elements C 软件开启和操作界面简介1-15NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38 第四章: 图像的保存和查看39-42 第五章：图像分析43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53第一章Ti-E 显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC 检偏器）；平衡片；ND---减光片；“G IF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；光片和用于PFS 的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；（2）视场光阑；（11）ND 减光片；（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；（4）起偏器（DIC 用）；（13）透射光电源；（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；（6）孔径光阑；（15）PFS 控制器（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB 控制器遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC 检偏器切换按钮；3）DIC 检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS 开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。

*请注意：CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。

前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS 开关按钮和PFS 聚焦状态指示灯（需要选购PFS 部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC 检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2 毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB 控制器（显微镜示意图15 位置）右侧的电源开关打开。

激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。

仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。

1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。

照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。

在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。

激光共聚焦显微镜的使用和应用激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种在生物医学领域应用十分广泛的高分辨率显微镜技术。

相比传统的荧光显微镜，LSCM独特的成像原理和功能使其在细胞生物学、生物医学研究以及材料科学等方面具有非常重要的应用。

LSCM使用的原理是激光扫描和共聚焦。

首先，通过激光光源发出的单色激光束照射样品，并经过镜片的调焦使得激光聚焦于单个样品点上。

样品中的物质吸收或发射荧光，在共焦点由反射镜反射回来，进入到光学检测系统中，并通过光学系统传达给光电倍增管，再由电信号转换为图像信息。

通过光学透镜逐点扫描整个样品，构建出样品的二维或三维图像。

LSCM相比传统显微镜具有以下几个优点：1.高分辨率：借助共焦技术，可以消除背景杂乱的荧光，只能检测到焦点附近的物质，因此在图像质量上表现出非常高的分辨率。

2.光学切片：可以通过调整镜片的焦距，只聚焦在感兴趣的层面上，可以在三维空间内获得细胞、组织的立体结构信息。

3.高亮度和低光毒性：由于采用单光子激发方式，LSCM提供了高亮度、低光毒性和低伤害的成像模式，可以更好地保护生物样品。

LSCM在生物医学领域的应用非常广泛：1.细胞观察与研究：LSCM可以观察到细胞的三维结构、蛋白质、DNA、RNA等生物分子标记，并通过共焦显微镜的三维成像技术，对细胞内的致病因子和细胞的活动过程进行实时观察和分析，从而揭示细胞的功能和机制。

2.分子定位和交互：通过标记荧光分子，LSCM可以实现对分子在细胞内的定位和相互作用的观察，如蛋白质的定位、互作关系等。

通过这些观测，可以更好地了解分子间的相互作用以及其在细胞功能和疾病发展中的作用。

3.组织学研究：LSCM在组织学研究中可以提供更高分辨率的图像，可以观察到组织的细胞构成、细胞外基质和多种细胞标志物等。

这对于了解组织结构与功能的关系，以及细胞增殖、细胞死亡等生理过程具有重要意义。

激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用孙学俊;闫喜中;郝赤【摘要】激光共聚焦显微镜(共聚焦显微镜)是在生物学研究中最通用的荧光显微镜工具之一.它的广泛流行是因为其优越的光学切片和3维(3D)重建功能.不同于普通显微镜观测厚样本时由于被聚焦外光线干扰导致模糊图像,激光共聚焦显微镜可以从比较厚的生物样本在短期内获得清晰的光学切片.激光共聚焦显微镜所得到的一幅完全对齐的3D图像系列允许对样本在虚拟空间的任意角度观测.该技术越来越成为现代生命科学研究中必不可少的一项研究工具.本文的目的是为研究生和青年研究人员提供一些使用激光共聚焦显微镜的基础知识并对它的应用做简单的介绍.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】10页(P1-9,14)【关键词】荧光;共聚焦;显微镜;细胞影像;三维图像重组【作者】孙学俊;闫喜中;郝赤【作者单位】山西农业大学农学院,山西太谷030801;阿尔伯特大学医学院肿瘤研究所,加拿大埃德蒙顿 T6G1Z2;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】TH742.64★特约稿件显微镜可能是生物研究实验室中最古老的仪器之一。

100多年以来，它的基本结构并没有多大的改变。

随着各种增加图像对比度的显微镜技术的发明，比如相差显微技术( DIC , Differential Interference Contrast)、荧光显微镜技术等使显微镜成为现代科学研究中一项更必不可少的研究技术手段之一。

然而没有一项显微镜技术的比激光扫描共聚焦显微镜(共聚焦显微镜)在生物学领域应用的影响大，共聚焦显微镜能够成为生物研究中最普遍的荧光显微镜工具无疑是基于其卓越的光学切片和三维重建的能力，该技术可以方便快捷地从比较厚的生物样品获得的清晰的光学切片，而且对样品的任何可能的角度可以作进一步的观测从而获得三维图像。

Leica TCS SP2 激光共聚焦显微镜系统操作手册一、荧光显微镜Leica DMRE的使用A：步距调节B：电动升台按钮C：电动降台按钮D：微调E：上限设置F：下限设置1、观察、扫描转换拉杆2、卤素灯开关3、透射光探测器开光横档4、荧光光路开关5、荧光滤镜转盘1：DAPI；2：TRITC；3：FITC；4：SCAN6、镜头侧DIC棱镜转盘7、与镜头相配DIC滤块8、起偏器9、检偏器10、镜头侧DIC棱镜微调旋钮11、光强调节纽12、减光滤光片13、孔径光阑14、视场光阑选择合适的镜头Leica TCS SP2 镜头配置镜头类型使用介质放大倍率/数值孔径编号HC PL APO CS DRY 10X /0.4 506511HC PL APO CS DRY 20X/ 0.7 506513HC PL APO CS DRY 40 X 0.85/ CORR 506140HC PL APO Ibd.BC OIL 63X /1.4 506192Leica TCS SP2 AOBS 镜头配置镜头类型使用介质放大倍率/数值孔径编号HC PL FLUOTAR DRY 10X/0.3 506505HC PL FLUOTAR DRY 20X/0.5 506503HCX PL APO OIL 40X/1.25-0.75 506176HC PL APO Ibd.BC OIL 63X/1.4 506192 HCX PL APO CS OIL 100X/1.40-0.70 506038 WATER HCX APO L U-V-I WA TER 63X/0.9 506148荧光观察荧光光路开关至“O”位，转轮至“1.0×”位，转换拉杆完全推进，荧光滤块换到相应号位（1：DAPI；2：TRITC；3：FITC；4：SCAN）图像输出扫描荧光光路开关至“I”位，转轮至“UV”位，转换拉杆完全拉出，荧光滤块换到4：SCAN）荧光观察（以油镜观察为例）1、样品正面朝上正确放在显微镜样品台上，点上镜油。