生物化学实验原理

生化实验原理

细胞传代：细胞培养是将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的一种方法。细胞是组织构成的基本单位，细胞培养技术是研究活细胞结构及生物学功能的良好方法，同时也是研究基因表达调控和分子生物学必不可少的研究手段，随着细胞培养技术的承受和兴起，其在基础医学和临床医学领域得到广泛认可和重视，在对细胞形态学、细胞生物学和细胞遗传学以及病毒学、免疫学、组织学、血液学、肿瘤学等方面的研究中，细胞培养技术发挥着不可替代的作用。

质粒转化：质粒是一种染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。转化（transformation）是将质粒DNA导入另一细菌体内，使受体细菌获得新的遗传性状（如药物抗性）的一种方法。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热激和冷却处理，促进细菌吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。进入细菌的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细菌表现新的遗传性状。将转化后的细菌在含有相应抗生素的培养基中生长，并根据蓝白斑筛选原理，筛选出转化子（transformant），即带有外源DNA分子的大肠杆菌。通过培养大肠杆菌，使质粒得到大量扩增。

去内毒素质粒提取：外毒素和内毒素是细菌产生的两大类毒素物质。外毒素是病原菌在代谢过程中分泌到菌体外的物质。外毒素的化学成分是蛋白质，毒性极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。用3~4%的甲醛溶液处理，其毒性完全消失。外毒素的抗原性较强，能刺激机体产生毒素。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，是磷脂-多糖-蛋白质（phospholid-polysaccharide-protein）复合物，主要成分是脂多糖（lipopolysaccharide, lps）。细菌在生活时不能释放出来，当细菌死亡而溶解或用人工的方法破坏菌体时才释放出来，因而称为内毒素。内毒素的性质比较稳定，其作用没有组织器官特异性，能引起机体体温升高，腹泻和出现出血性休克和其他组织损伤现象。内毒素耐热性非常好，在100℃的高温下加热1 h也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2~4 h，或用强酸、强碱及强氧化剂煮沸30

min才能破坏其生物活性。本实验是在碱裂解法的基础上增加了去内毒素的抽提步骤，同时也增加了菌的量，使最后得到的质粒DNA质量高、纯度大，降低了在转染过程中对细胞的毒害。

基因质粒的瞬时转染：转染（transfection）指由于外源分子如DNA或RNA等导入真核细胞并使其获得新的遗传表型的过程。DNA转染技术的发展对现代分子生物学产生了巨大的影响。基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具，而且是目前基因治疗的关键步骤。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法以及病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒感染法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响。所以现在对于很多普通细胞系，一般的转染方法多采用脂质体法。

细胞总蛋白的提取：蛋白质裂解液的配方有很多种，如何选择合适的蛋白质裂解液是做好免疫印迹的第一步。细胞裂解液的主要目的：1. 利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2.

溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性。一些含有SDS（十二烷基硫酸钠）和强离子去污剂（如：脱氧胆酸钠）的蛋白质裂解液能从组织或细胞中提取出大量的蛋白质，然而它们却很容易会使蛋白质变性。这样，对于一些只能识别非变性的抗原表位的抗体来说，那些能使蛋白质变性的含SDS和强离子去污剂的蛋白质裂解液就不能被选择。所以，蛋白质裂解液的选择除了要根据其“产量”，还要看所选择的一抗的是否能识别经变性的蛋白质样品。一般对于不能识别变性的蛋白质样品的一抗，其蛋白质裂解液都会是含有较温和的非离子去污剂（如：NP-40，Triton X-100）。

蛋白免疫印迹Western blot： Western blot是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法，是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫生化技术。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。其基本过程为，首先将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离。然后将分离到的蛋白质转印到固相载体上。常用的固相载体包括NC（硝酸纤维素）膜和PVDF（聚偏氟乙烯）膜。通常使用的PVDF膜的规格是0.45 μm，如果靶蛋白的分子量小于20 kDa，则选用0.22 μm的PVDF膜。转膜的方式有湿转和半干转。再次，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与膜进行杂交，使抗体与靶蛋白特异性结合后，再与经辣根过氧化物标记的二抗结合。最后，用化学发光试剂ECL反应，经成像系统成像等一系列步骤，检测靶蛋白的表达水平。

MTS： MTS是一种旨在通过四氮唑和电子偶联化合物在代谢旺盛细胞中的脱氢酶的作用下，被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的蓝紫色甲臜产物，甲臜产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。细胞增殖越多越快，则颜色越深。因此可通过检测信号来比色定量测定活体细胞繁殖。MTS为新一代四氮唑蓝盐化合物，其被还原形成的蓝紫色结晶甲瓒Formazan产物水溶性和稳定性更高，显色更快。它与MTT的应用原理相同，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成各自有色的甲瓒产物，其颜色深浅与某些敏感细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关。其原理与MTT相似。不过MTS比MTT少了加二甲基亚砜（DMSO）这一步骤，因此，MTS更为方便。

transwel：transwell是专门用于研究细胞移动能力的一种小室，这种小室底部是一种有通透性的聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane），膜上带有微孔，孔径大小介于0.1~12.0μm。将细胞用无血清培养基接种在上室（transwell小室内），下室（装transwell小室的培养板内）盛装含有血清的正常培养基。由于聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可以影响上室内的细胞的生长和运动，经过一段时间的培养，细胞会才上室移动到下室。在设定的时间内，通过计数下室的细胞数量来反映细胞移动能力的强弱。

划痕：细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。该方法模拟了体内伤口愈合过程中的细胞迁移。基本步骤涉及在细胞单层中创建“伤口”，并在细胞从开始至“伤口”愈合的迁移期间（如12 h，24

h，36 h等）定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移的速率。“伤口”区域在设定的时间内越早被周边细胞占据（或修复），则视为移动能力越强。该检测特别适用于定向细胞迁移及其通过与细胞外基质ECM和细胞间相互作用的细胞相互作用进行调节的研究。

平板克隆：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁细胞和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要形状。

细胞总RNA的提取：RNA是一类极易降解的核酸分子。要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地内源性及外源性RNA酶对RNA的降解作用。通过高强度的变性剂使RNA酶失活，RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，通过氯仿出去蛋白质和细胞碎片等杂志，从而得到纯化的总RNA。

反转录：反转录（Reverse Transcription）又称为逆转录。其原理是：成熟的mRNA大多具有Ploy A尾，根据这一特点，采用与之相互补的Oligo(dT)为引物，在逆转录酶作用下，以mRNA为模板，反转录合成互补DNA（cDNA）第一链库。在此基础上，再利用靶基因的特异引物，进行PCR扩增，即可获得特异性靶基因。

实时荧光定量PCR技术Real-Time RT PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对位置模板进行定量分析的方法。在PCR反应体系中，加入过量SYBP荧光染料，SYBP荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBP染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增加完全同步。随着PCR循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时监测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品（如β-actin）作对照，即可得出待测样品目的基因的拷贝数。

ChIP: 染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。