水生动物致病菌_柱状黄杆菌研究进展
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实用技术—鱼病诊治责任编辑 李振龙《中国水产》2009年第10期59 柱状黄杆菌(Flavobacterium columnaris )属于黄杆菌目,黄杆菌科,黄杆菌属,是一种严格需氧的革兰氏阴性菌,菌体呈细长弯曲状,具有滑动能力和团聚性,在世界范围内的水体环境和土壤中均有分布,其宿主范围极其广泛,可以感染包括鲑科、鲤科、鲶科、鲻科、太阳鱼科、鲈科等多个科的鱼类,几乎所有的淡水鱼类均对该菌敏感,而自然和养殖条件下的海水鱼类以及观赏鱼类也可感染发病。
柱状黄杆菌是一种世界范围的水生动物致病菌,是我国重要养殖鱼类草鱼、鳜等烂鳃病的病原,也是其它重要经济鱼类如斑点叉尾鮰、鲑鱼和鲤鱼等柱形病的病原。
全球每年由于感染柱状黄杆菌引起鱼类发病死亡所造成的经济损失极其严重。
目前,国内外学者对柱状黄杆菌研究报道逐年增多,然而关于该菌的系统性研究综述尚未见报道,因此本文从该菌的发现与分类、理化特性和分离鉴定、血型抗与抗原性、致病性与致病机理和免疫研究五个方面进行综述,旨在进一步丰富、完善柱状黄杆菌的理论研究资料。
一、发现与分类地位柱状黄杆菌广泛分布淡水环境和土壤中,能分解环境中的有机物。
在细菌系统分类学上,柱状黄杆菌曾多次易名,并被划分至相应的菌属。
1922年,Davis首次报道了一种能引起多种淡水鱼类发生特殊皮肤疾病的罕见的运动性革兰氏阴性杆菌,并最初将病原菌命名为柱状芽孢杆菌;1944年,Ordal等从发生柱形病的红鲑鱼苗分离到病原菌,将其划至软骨球菌属,命名为柱状软骨球菌;1945年,Garnjobst将从感染鲇鱼分离到的病原划至纤维粘菌属,命名为柱状纤维粘菌;1974年,Leadbetter将该菌划至屈挠杆菌属,命名为柱状屈挠杆菌;直到1966年,Bernardet等根据DNA-rRNA原位杂交试验数据、细菌脂肪酸和菌体蛋白电泳分析结果,将该菌划至黄杆菌属,命名为柱状黄杆菌,于是柱状黄杆菌作为统一的命名被人们沿用至今。
淡水鱼虾细菌病诊断与防控技术研究进展蔺凌云;潘晓艺;袁雪梅;姚嘉赟;徐洋;尹文林;沈锦玉【摘要】In this article,the common bacterial diseases in freshwater fishes and shrimps were summarized and introduced,including bacterial septicemia,bacterial enteritis,bacterial gill-rot disease,streptococcal disease,delayed Edwards disease,intestine-likeenteropathies,nocardiosis,acute hepatopancreas necrosis and spiroplasmosis,etc. Meanwhile,the research progress of detection methods for bacterial diseases endangering freshwater aquaculture industry in and outside China were also summarized,which included detection methods based on physiological and biochemical characteristics of pathogens and on the molecular biology techniques(such as common PCR method,real-time quantitative PCR technology,loop-mediated isothermal amplification technology, 16S rRN detection method,nucleic acid probe hybridization method,and gene chip technology),as well as the detection methods based on immunology(such as immunoenzymatictechnology,immunofluorescence,colloidal gold immunochromatography and antibody chip technology). According to the above summary,it was indicated that more attention should be paid to technology research and development of surveillance,early warning,immunity, drug and ecology and comprehensive prevention and control. As a conclusion,the research in this article would provide references for the bacterial disease diagnosis in freshwater aquaculture industry,standardization of detection methods andcommercialization of testing products.%本文概述了淡水鱼虾常见的细菌性疾病,包括细菌性败血症、细菌性肠炎、细菌性烂鳃、链球菌病、迟缓爱德华氏菌病、鮰类肠败血症、诺卡氏菌病、急性肝胰腺坏死病和螺原体病等,并对近年来国内外主要淡水养殖细菌性病害检测方法的研究情况进行综述,包括基于病原菌生理生化特征的检测方法、基于分子生物学技术的检测方法(如常规定性PCR检测方法、实时定量PCR技术、环介导等温扩增技术、16S rRNA检测技术、核酸探针杂交法和基因芯片技术等),以及基于免疫学相关技术的检测方法(如免疫酶技术、免疫荧光技术、胶体金免疫层析技术和抗体芯片技术等),提示在防控方面应该注重监测预警、免疫、药物、生态和综合防控等技术.本文为淡水养殖细菌性病害的诊断、检测方法的标准化及推动相应检测产品的商品化提供了参考.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2018(035)006【总页数】6页(P83-88)【关键词】细菌性疾病;鱼;虾;诊断技术;防控技术【作者】蔺凌云;潘晓艺;袁雪梅;姚嘉赟;徐洋;尹文林;沈锦玉【作者单位】浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001;浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001;浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001;浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001;浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001;浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001;浙江省淡水水产研究所,浙江省鱼类营养与健康重点实验室,浙江湖州313001【正文语种】中文【中图分类】S9431 淡水鱼虾主要细菌病1.1 淡水鱼主要细菌病1.1.1 细菌性败血病(暴发性出血病)该病是危害最大、流行地区最广、流行季节最长、造成损失最严重的一种淡水养殖鱼类急性传染病。
柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定刘国勇;聂品【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2007(14)5【摘要】柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种世界范围的水产动物致病菌,是中国重要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等烂鳃病的病原.本研究以1972年从患"烂鳃病"草鱼上分离的两株冻干柱状黄杆菌G4和G18菌株为研究对象,并将G4株再次分离纯化得纯化菌株,命名为G4R3.对草鱼鱼苗浸泡攻毒结果显示,G4R3的LD50至少比G18的高3个数量级,因此G4R3为"强毒株",G18为"弱毒株".利用蛋白质组学方法分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,经过双向电泳并结合图像分析,共发现了34个点是差异表达的蛋白.胶内酶解、肽质量指纹图谱和串联质谱分析后,鉴定出其中的7个蛋白点,代表滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和一种可能的膜蛋白等3种蛋白,它们可能是柱状黄杆菌的毒力因子.[中国水产科学,2007,14(5):807-814]【总页数】8页(P807-814)【作者】刘国勇;聂品【作者单位】中国科学院,水生生物研究所,淡水生态与生物技术国家重点实验室,湖北,武汉,430072;中国科学院,水生生物研究所,淡水生态与生物技术国家重点实验室,湖北,武汉,430072【正文语种】中文【中图分类】S94【相关文献】1.利用M基因鉴别新城疫病毒中强毒株与弱毒株RT-nPCR方法的建立 [J], 朱小甫;吴旭锦2.基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株[J], 秦智锋;廖立珊;孙洁;张彩虹;花群义;刘建利;卢体康;林庆燕;吕建强;曹琛福;阮周曦;曾少灵;陈书琨3.2型猪链球菌强毒株与无毒株胞外蛋白的双向电泳图谱比较分析 [J], 张爱玲;王兴龙;李吉平;冯书章;张辉;卜昭阳4.弓形虫Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗强毒株致死性感染的免疫保护作用 [J], 陈守斌; 王维; 何佳丽; 崔雯; 王聪; 陶晴; 计永胜; 罗庆礼; 胡晓东; 沈继龙5.感染非洲猪瘟强毒株和弱毒株的野猪排毒方式的差异 [J], 张文志;刘金因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
中西药联用对柱状黄杆菌体外抑菌作用研究摘要:柱状病的病原是柱状黄杆菌,柱状黄杆菌可以感染草鱼、鲤鱼、斑点叉尾鮰、银龙鱼、虫纹鳕鲈等鱼类,几乎所有的淡水鱼类都易感。
感染初期鳍条顶端、吻端,皮肤鳃丝末端生长繁殖,形成黄白色点状病灶,随着病情发展,鳍条蛀烂,向基部溃烂,鳃丝溃烂。
以柱状黄杆菌为研究对象,进行了中西药单方及复方制剂的体外抑制试验。
关键词:中西药;柱状黄杆菌;体外抑菌;作用1材料方法1.1菌株柱状黄杆菌分离于发病虫纹鳕鲈Murraycod(Maccullochellapeeliipeelii);恩诺沙星、复方磺胺二甲氧嘧啶、氟苯尼考购于北京渔经公司;黄柏、黄芩、金银花、板蓝根、苦参、大黄、鱼腥草、五倍子、穿心莲、黄芪、大青叶、连翘购自甘肃省卓尼县九峰生态药业有限责任公司。
1.2方法1.2.1药品制取药物母液的制取:称取市场上选购的药物50mg,溶于50mL杀菌水,彻底融解后0.22μm滤膜过虑除菌,制取成1000mg/L的药水,4℃储存备用。
中草药材的制取:称取10g药品,添加杀菌水100mL泡浸1h,煎制0.5h,不时开展拌和,药水用尼龙沙布过虑,滤渣再度煎制、过虑,合拼药水后,水浴萃取至50mL,药水浓度值即为200mg/mL,5000rpm离心,取上清,0.22μm滤膜过虑除菌。
配置好的药品分装于1.5mL杀菌离心管中,-20℃储存备用。
1.2.1药品的初筛选用纸片蔓延法,参考杭州天和微生物菌种有限公司具体操作指南开展,黄杆菌选用Shieh培养基。
匀称涂布实验菌液(1.0×108CFU/mL)于平板上,将空缺药敏纸片平贴于平板上(4片/平板),每个空缺纸滴加5μL药水,28℃培养48h,用精度1mm尺子测量抑菌环的直径,并纪录结果。
1.2.2药品的最少抑菌浓度值测定根据基本挑选结果,挑选出具备优良抗菌效果的药品,明确最少抑菌浓度值。
在1.5mL离心管中开展,第一管添加900μL液态培养基,第2至12管各自添加500μL培养基,第一管加上100μL液态,充足混和并吸出500μL第二管添加L,先后稀释液两次,直到最后一管。
实用技术—鱼病诊治责任编辑 李振龙《中国水产》2009年第10期59 柱状黄杆菌(Flavobacterium columnaris )属于黄杆菌目,黄杆菌科,黄杆菌属,是一种严格需氧的革兰氏阴性菌,菌体呈细长弯曲状,具有滑动能力和团聚性,在世界范围内的水体环境和土壤中均有分布,其宿主范围极其广泛,可以感染包括鲑科、鲤科、鲶科、鲻科、太阳鱼科、鲈科等多个科的鱼类,几乎所有的淡水鱼类均对该菌敏感,而自然和养殖条件下的海水鱼类以及观赏鱼类也可感染发病。
柱状黄杆菌是一种世界范围的水生动物致病菌,是我国重要养殖鱼类草鱼、鳜等烂鳃病的病原,也是其它重要经济鱼类如斑点叉尾鮰、鲑鱼和鲤鱼等柱形病的病原。
全球每年由于感染柱状黄杆菌引起鱼类发病死亡所造成的经济损失极其严重。
目前,国内外学者对柱状黄杆菌研究报道逐年增多,然而关于该菌的系统性研究综述尚未见报道,因此本文从该菌的发现与分类、理化特性和分离鉴定、血型抗与抗原性、致病性与致病机理和免疫研究五个方面进行综述,旨在进一步丰富、完善柱状黄杆菌的理论研究资料。
一、发现与分类地位柱状黄杆菌广泛分布淡水环境和土壤中,能分解环境中的有机物。
在细菌系统分类学上,柱状黄杆菌曾多次易名,并被划分至相应的菌属。
1922年,Davis首次报道了一种能引起多种淡水鱼类发生特殊皮肤疾病的罕见的运动性革兰氏阴性杆菌,并最初将病原菌命名为柱状芽孢杆菌;1944年,Ordal等从发生柱形病的红鲑鱼苗分离到病原菌,将其划至软骨球菌属,命名为柱状软骨球菌;1945年,Garnjobst将从感染鲇鱼分离到的病原划至纤维粘菌属,命名为柱状纤维粘菌;1974年,Leadbetter将该菌划至屈挠杆菌属,命名为柱状屈挠杆菌;直到1966年,Bernardet等根据DNA-rRNA原位杂交试验数据、细菌脂肪酸和菌体蛋白电泳分析结果,将该菌划至黄杆菌属,命名为柱状黄杆菌,于是柱状黄杆菌作为统一的命名被人们沿用至今。
二、理化特性及分离鉴定1.形态与运动性 柱状黄杆菌菌落形态大小不一,中央较厚,显色较深,并向四周扩散成颜色较浅的假根须状。
从病鱼病变部位直接采集病料或新鲜培养物中的细菌,其形态比较均一,大小0.5µm~0.7µm×4µm~8µm,少数菌体长度达15µm~25µm。
随着培养时间的延长,细菌菌体变长,呈极不规则的形态,如长丝状、波状或轮状等,其老龄培养物常形成不规则的圆球体状颗粒。
一般在附着在病灶区或生长在固体培养基上的菌体较短,在液体培养中的菌体较长。
柱状黄杆菌具有团聚性和滑动能力,因此在滴上适量生理盐水的载玻片上稀释细菌时,细菌常常聚集成一团,而且多数细菌的一端常常固着在载玻片上,而另一端却在生理盐水中缓慢滑动。
2.生化特性 柱状黄杆菌氧化酶、细胞色素酶、接触酶反应均为阳性;产生H 2S,液化明胶,分解酪素和酪氨酸;水解吐温20和吐温80,溶解大肠杆菌;赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸试验阴性;不利用淀粉、几丁质、琼脂、纤维素;不利用除葡萄糖以外的其他碳水化合物,不还原硝酸盐。
显然,只有继续完善柱状黄杆菌生化反应特性资料才能使人们更全面的了解该菌的生化特性。
3.分离鉴定 从发病鱼体表损伤部位、鳃以及口腔等部位取组织接种培养是分离柱状黄杆菌的重要途径,曾有报道从发病虹鳟鱼苗的肾脏和肝脏可分离到病原,但Tripathi 等从人工感染鲤鱼的内脏器官中却没有检出该菌。
柱状黄杆菌能够在噬纤维菌培养基(cytophaga agar)、蛋白胨酵母培养基、Chase培养基、Shieh培养基上均生长良好,但污染菌的普遍存在大大降低了病原成功分离的几率,因此人们在培养基中添加对柱状黄杆菌的生长不影响而对其他污染菌生长有抑制作用的抗生素药物,制成用于柱状黄杆菌分离的选择性培养基,如改良的cytophaga培养基和改良的Shieh培养基等。
对于柱状黄杆菌的鉴定,人们常用的方法有细菌生长表型观察、血清凝集反应和生化鉴定法,也有人采用DNA同源性比对法、DNA-rR NA原位杂交和蛋白酶多样性比较法,而上述方法中均存在不足,如鉴定前必须先进行细菌分离和纯化或对于细菌含量低的样品反应不敏感性,因此最近便有人提出针对包括柱状黄杆菌在内的五种鱼类常见病原菌而设计的多重PCR方法,并取得了很好的诊断效果。
三、血清型与抗原性Robert 等将4株来源不同的柱状黄杆菌接种于肉汤培养基,以灭活的柱状黄杆菌与弗氏佐剂混合后经皮下多点注射兔子,免疫10天后耳缘静脉取血制备抗血清,并用于对325株柱状黄杆菌临床分离株的血清型分型研究。
除两株菌外,其他受试菌按血清凝集反应结果可将其划分为4个血清型。
柱状黄杆菌的血清型与地理分布及致病力大小之间没有关联,即使是血清型相同的菌株,其毒力也是强弱各异,由此可见,柱状黄杆菌的血清型与其细菌抗原性没有明显相关性。
Pacha等发现柱状黄杆菌不能与亲缘关系相近的细菌性烂鳃病原或冷水性病原菌嗜冷黄杆菌抗血清发生凝集反应,这种现象相对于同属异种菌株而言,柱状黄杆菌具有独立的血清型。
在国内,陈昌福等通过对从1972年到1992年分离自不同患病淡水鱼上的40个菌株进行交叉凝集和琼脂扩散反应,发现从我国各地收集的柱状黄杆菌存在三种血清型,即:GR-1、GR-2及GR-3,但关于这三种血清型的菌株与其抗原性之间内在关系水生动物致病菌——柱状黄杆菌研究进展黄锦炉 汪开毓 黄艺丹 陈德芳四川农业大学动物医学院鱼病研究中心 625014实用技术—鱼病诊治责任编辑 李振龙60 《中国水产》2009年第10期的研究尚未见报道。
四、致病性与致病机理1.感染宿主 柱状黄杆菌呈世界范围分布,是一种全球性的危害极广的细菌性鱼病病原菌,能感染温水域和冷水域的大部分淡水鱼、海水鱼以及观赏鱼类。
柱状黄杆菌的宿主范围极为广泛,可感染包括斑点叉尾鮰、鲤鱼、大西洋鲑、金鱼、虹鳟、日本鳗鲡、海鳟等36种重要经济鱼类和观赏鱼类。
2.致病条件 柱状黄杆菌是一种条件性致病菌,它的毒力受到许多环境因子的影响,如水体盐度、温度、饲养应激等等。
不同菌株之间由于毒力存在差异,引起鱼类发病率和死亡也明显不同;而对于某些鱼类而言,病情一旦爆发流行,鱼类的死亡率最高可达100%。
引起柱状黄杆菌感染的条件并不是单一的,而常常是多种影响因素共同作用的结果。
① 组织损伤因素:完整的鳃组织和皮肤是鱼类保护自身免受细菌感染的天然屏障,而损伤的鳃组织和皮肤则因天然屏障保护功能部分丧失而使鱼类容易遭受感染。
有研究证明:柱状黄杆菌不能在体表完整的健康大西洋鲑中传播,但是却可以引起体表有裂痕的鲑鱼的发生感染。
② 温度因素:当环境变化和水温上升至病原菌的最适生长温度时,许多鱼类都对柱状黄杆菌均表现敏感,这也是许多淡水鱼类和冷水鱼类暴发柱状病的重要因素,鱼类自然感染柱状黄杆菌经常发生在水温大于20℃的水体环境中,当水体温度为6℃~12℃时,淡水鱼也可感染发病,可见温度条件并不是恒定的影响因素;③ 环境因素:某些环境因素如拥挤、某些不当操作、低溶氧量、高温及水体富营养化等也容易导致柱形病的发生;④ 病原因素:水体环境中病原菌的浓度以及菌株毒力的强弱与鱼类感染发病关系密切。
Shoemaker 等试验发现,基因型Ⅱ的柱状黄杆菌对斑点叉尾鮰鱼苗的毒力比基因型Ⅰ的要明显增强,而基因型Ⅱ菌株对斑点叉尾鮰幼鱼鳃丝的粘附力比基因型Ⅰ的也明显增强。
因此,如果水体环境中的病源菌的浓度过高或是菌株毒力较强,鱼类则容易感染发病。
⑤ 宿主因素:一般而言,柱状黄杆菌不易健康鱼感染,但如果鱼类自身免疫力及其营养状况不佳,鱼类也是容易感染的;⑥ 继发感染:柱状黄杆菌不仅可以是原发性病原,也可以是继发感染的病原,鱼类处于疾病状态时,因其自身抵抗力下降而大大提高了柱状黄杆菌继发感染的几率,例如患水霉病的斑点叉尾鮰,其体表完整性由于水霉的广泛寄生而受损,柱状黄杆菌往往通过粘附在受损皮肤或鳃丝上而引起斑点叉尾鮰感染发病,随着病情的恶化即可引起斑点叉尾鮰的大量死亡。
3.致病机理 由于柱形病难以通过人工试验完全重现,因此人们对于柱状黄杆菌的致病机理仍不完全明确,但有研究发现,其致病机理主要与菌株的毒力因子有关,而不同基因型组的菌株之间毒力也存在差异的,这种差异与菌株的结缔组织降解酶、软骨素AC裂合酶活性和对鳃组织的粘附能力关系极为密切。
虽然对柱状黄杆菌胞外蛋白和外膜蛋白基因与毒力之间的内在关系尚未明确,但从致病菌株与无致病力菌株之间的脂多糖和膜蛋白研究发现,诸如脂多糖和荚膜组分物质通常是致病菌株的重要毒力因子。
在早期对柱状黄杆菌的致病机理的研究报道中,多数以自然感染鱼类为主,而且几乎所有研究均侧重于从鳃损伤途径进行研究,忽略了从皮肤感染途径对发病机理的研究。
Tripathi 等以柱状黄杆菌人工感染体表经人工划伤的健康鲤鱼并对其致病机理进行研究,结果发现试验鱼用去垢剂除去体表黏液的一侧体表常常发生感染,且感染区很快发展为皮肤溃疡,而未除去体表黏液的一侧体表则表现正常,并且发病鱼均标志性的出现低钠血和低氯血现象,疾病症状主要表现为皮肤病,但发病鱼鳃损伤的现象并不一定伴随出现,而Speare 等认为柱状黄杆菌的感染可引起鲑鱼鳃丝发生严重坏死。
Bader 等采用了不同外界刺激条件,比较了柱状黄杆菌对经机械划伤、烙伤、冻伤和氨水浸渍四种方式处理过的斑点叉尾鮰上皮组织的损伤变化,试验发现,冻伤和氨水浸渍几乎不引起试验鱼上皮组织的损伤,试验鱼的死亡率均极低,与对照组差异不显著;而机械划伤和烫伤试验鱼上皮组织均发生深度损伤,死亡率分别为60%和2%。
据此可知,柱状黄杆菌对不同鱼类的侵染机制和引起的症状存在一定的差异,而且以不同的外界条件为诱因侵染引起鱼类的组织损伤、发病率和死亡率也存在差异。
五、免疫研究 一直以来,对柱状黄杆菌的免疫研究受到国内外学者的高度重视。
Bader等在比较柱状黄杆菌全细胞溶解产物的免疫原性时发现,经高压灭活和福尔马林灭活的F. columnare全细胞裂解产物中共同存在100kD、80 kD、66 kD和60kD四种蛋白,结果发现两种方式灭活的前三种裂解产物均能与自然感染和人工感染柱状黄杆菌的斑点叉尾鮰血清发生特异性反应,而经福尔马林灭活的菌体大小60kD的裂解产物却不能与上述血清反应,这可能与该产物活性结构受到福尔马林钝化有关,因此作者认为柱状黄杆菌的福尔马林灭活苗不适合用于柱形病的预防。
孙宝剑等指出柱状黄杆菌细胞壁中大小为17.5kD的脂多糖组分和大小为24.4kD 的外膜蛋白组分别与受免鳜鱼血清发生特异性反应,而免疫印迹结果表明这两种细胞壁组分较有较强的免疫原性。
李惠芳等以柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和鮰爱德华菌三联灭活苗免疫斑点叉尾鮰,试验发现受免鮰鱼产生了对三种致病菌的特异性凝集抗体和交叉凝集抗体,而且受免鱼的头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性也明显增强。