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《兽医免疫学》实验课件：实验二 沉淀反应

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实验二 沉淀试验

实验二 沉淀试验

（一）炭疽环状沉淀试验
方法与步骤:
① 取3支口径0.4cm的小试管，在其底部各加约 0.1ml的炭疽沉淀血清。 ② 取其1支，用毛细管将待检抗原沿着管壁重 叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐 的界面，注意勿产生气泡。 ③ 另2支小试管，一支加炭疽阳性抗原，另一 支加生理盐水，作为对照。（如图）
实验二
沉淀试验
目的要求 1、掌握炭疽杆菌环状沉淀试验的操作技 术和结果观察。 2、掌握炭疽杆菌琼脂扩散试验的基本操 作技术和结果观察。
沉淀试验： 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、 菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相 应的抗体结合后，在适量电解质存在下， 形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验
炭疽琼脂扩散试验加样式意图
④ 作用 将琼脂凝胶板放置湿盒中，于37℃扩散24～
72h，每天观察结果，观察三天。
⑤ 结果观察 抗原抗体扩散时，在两孔间比例最合适的位 置出现白色沉淀线，出现白色沉淀线即为阳 性反应，不出现白色沉淀线为阴性反应。
炭疽琼脂扩散试验结果
抗原——沉淀原 抗体——沉淀素
沉淀试验的类型： 液相沉淀试验 环状沉淀试验 絮状沉淀试验 固相沉淀试验 琼脂凝胶扩散试验 免疫电泳技术
实验材料
1、炭疽沉淀血清 由兽医生物药品厂生产供应。该血清是由免 疫的马血清分离。首免用炭疽芽孢苗，再以 炭疽强毒的死菌按3～4d的间隔，进行3～4次 加强免疫，抗体效价达到要求时，采血分离 血清。 2、炭疽沉淀抗原 由兽医生物药品厂生产供应。
炭疽环状沉淀试验加样式意图
④结果判定 5～10min内判定结果，上下重叠两液界面 上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组 中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加 生理盐水者应不出现白环。
（二）炭疽琼脂扩散试验

实验二抗体制备和凝集反应沉淀反应PPT参考课件

实验二抗体制备和凝集反应沉淀反应PPT参考课件
12
Ⅰ 单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体

Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
13
Ⅱ 双向琼脂扩散实验:
14
方法：
1. 微波炉中彻底融化1% 琼脂
2. 取5ml 琼脂均匀铺在载玻片上
凝固
3. 在琼脂板上打5个孔
4. 在孔中加入相应样品 5. 37℃, 孵育24h
7
4. 预期结果
上清 清亮 轻度混浊 中等混浊 混浊 与对照相同
沉淀 大的凝集块 大多凝集管底 小、部分凝集块 很小的凝集颗粒 无凝集现象
凝集程度 ++++ +++ ++ + -
8
管底沉淀 凝集程度
最高稀释比例
待测血清的滴度
9
Test 2 沉淀反应
——琼脂扩散实验
10
沉淀反应:
➢ 经典抗原抗体反应的一种。
制备绵羊红细胞溶液20%、 25%、30%、40%
取0.1ml 皮下注射
免疫小鼠
18
素材和资料部分来自 网络，如有帮助请下载!
➢
+
可溶性抗原
➢ 分类:
✓ 琼脂扩散 ✓ 环状沉淀反应 ✓ 絮状沉淀反应 ✓ 免疫电泳
相应抗体
沉淀线或沉淀环
11
➢ 琼脂扩散实验:
✓ 可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例 下形成沉淀线或沉淀环。
✓ 分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量实验
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性实验

2 沉淀反应

2 沉淀反应

一、单向扩散试验 （平板法）
定量试验
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
第五章
沉淀反应
沉淀反应（precipitation）是指在
适当条件下可溶性抗原与相应抗体发
生特异性结合而形成沉淀物的现象。
其特性与经典的抗原抗体反应相同。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段 第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 速但不可见。免疫比浊法 中的速率法就是利用此阶 段测定免疫复合物形成的 速率。
形成肉眼可见的大的免疫 复合物。沉淀线或沉淀环 的观察以及免疫比浊法中 的终点法就是测定此阶段 形成的复合物
分类
1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
透射比浊法和散射比浊法光路
IC
透射比浊法 I
I0
当复合物＜3×106dal， I≈Iθ;θ＜90°，散射 光的量代表IC的量。
θ
检测器A
Iθ 检测器B
散射比浊法
三、免疫浊度测定
1.透射比浊法（transmission turbidimetry)
80
10
15 20 25*
15
25 60 150*
7
10 35 90*
35
40 45 50
300
360 415 450
70
60 55 45
(三)免疫胶乳比浊法
原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 μm）， 在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳 颗粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单 个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗 粒使透射光减弱或散射光增强。

免疫学实验课沉淀反应19页PPT

免疫学实验课沉淀反应19页PPT
，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
免疫学实验课沉淀反应
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。

沉淀反应2

沉淀反应2

沉淀反应——双向琼脂扩散实验实验目的：1、掌握双向琼脂扩散实验的原理和用途2、掌握双向琼脂扩散实验的操作方法3、观察抗原抗体在琼脂板上形成的沉淀线实验原理：1、可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例下形成沉淀线或沉淀环。

2、双向琼脂扩散实验是定性实验。

将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，两者均可扩撒，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。

如果不是相应的抗原与抗体，就不出现沉淀线。

实验材料：羊抗人IgG标记为Ab，待测抗体标为抗原1,、抗原2生理盐水配制的1%琼脂玻片、打孔器、湿盒、37摄氏度恒温箱等实验方法：1、微波炉中彻底融化1% 琼脂2、取琼脂均匀铺在载玻片上3、待琼脂凝固后，在琼脂板上打5个孔4、在孔中加入相应的样品：中央孔加抗体，上下孔加抗原1，左右孔加抗原25、将琼脂板置于湿盒内，37摄氏度24h后观察结果。

注意事项：1、琼脂板一定平整、光滑、无气泡2、琼脂不可过厚3、孔中液体不可过满在中央孔与周围孔之间，如出现沉淀线，则为阳性反应，提示有相应抗体与抗原反应。

如无沉淀线出现，则为阴性反应，说明抗体与抗原不相对应。

实验结果分析：上图为某实验小组做出的实验结果，抗体与抗原1形成沉淀线。

我们小组没有出现沉淀线，可能有以下几个原因：琼脂太薄，抗原和抗体的量太少吞噬细胞的功能检测实验目的：1、了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理2、熟悉细胞吞噬作用的基本过程巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。

能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。

巨噬细胞受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。

实验材料：小鼠、鸡红细胞(1×107cells/ml)、6% 无菌淀粉溶液、0.03% 冷美兰实验方法：1、试验前3d，小鼠腹腔内注射1ml 6% 无菌淀粉溶液，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。

2、实验时，小鼠腹腔内注射1ml鸡红细胞，轻揉腹部，使菌液在腹腔中分布均匀，利于吞噬。

沉淀反应(免疫学检验课件)

沉淀反应(免疫学检验课件)
第十三章
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。

实验二--沉淀试验课件

4、生理盐水
( 一) 炭疽环状沉淀试验
方法与步骤:
① 取3支口径0.4cm的小试管，在其底部各加约 0.1ml的炭疽沉淀血清。
② 取其1支，用毛细管将待检抗原沿着管壁重 叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐 的界面，注意勿产生气泡。
③ 另2支小试管，一支加炭疽阳性抗原，另一 支加生理盐水，作为对照。 (如图)
实验二 沉淀试验
目的要求 1、掌握炭疽杆菌环状沉淀试验的操作技 术和结果观察。
2、掌握炭疽杆菌琼脂扩散试验的基本操 作技术和结果观察。
沉淀试验： 可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒素、 菌体裂解液、病毒、组织浸出液等) 与相 应的抗体结合后，在适量电解质存在下， 形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验
抗原——沉淀原 抗体——沉淀素
沉淀试验的类型： 液相沉淀试验 环状沉淀试验 絮状沉淀试验 固相沉淀试验
琼脂凝胶扩散试验 免疫电泳技术
实验材料
1、炭疽沉淀血清 由兽医生物药品厂生产供应。该血清是由免 疫的马血清分离。首免用炭疽芽孢苗，再以 炭疽强毒的死菌按3~4d的间隔，进行3~4次 加强免疫，抗体效价达到要求时，采血分离 血清。
炭疽琼脂扩散试验结果
炭疽环状沉淀试验加样式意图
④结果判定 5~10min内判定结果，上下重叠两液界面 上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组 中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加 生理盐水者应不出现白环。
(二) 炭疽琼脂扩散试验
Hale Waihona Puke 方法与步骤：① 琼脂板制备 称取1g琼脂粉，加至100ml 0.5%石炭酸生理 盐水中，煮沸使之溶解。待温度降至55℃左 右时浇玻板，厚约2~3mm左右。
2、炭疽沉淀抗原 由兽医生物药品厂生产供应。

医学免疫学实验课件-沉淀反应


沉淀物
目 录 末页
琼脂扩散实验
可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇， 在适当比例下形成沉淀线或沉淀环。
分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性
目 录 末页
沉淀反应分类
一、单向琼脂扩散 特点
1. 简单 2. 灵敏度较低约为：10－20μg 3. 1~2天才能看结果
目录
概述
一、单向琼脂扩散试验 二、双向琼脂扩散试验 三、火箭电泳 四、对流免疫电泳 五、免疫电泳
•目的要求
目 录 末页
目的要求
1.掌握对流免疫实验原理、操作过程及应用。 2.熟悉单向、双向琼脂扩散实验的原理、操作 过程及应用。 3.了解免疫电泳、火箭电泳实验的原理、操作 过程及应用。
目 录 末页
2. 取约4ml 琼脂液浇注在载玻片上
凝固
3. 打4个孔，孔径3mm，孔距6mm
_
+
4. 在孔中加入相应样品
Ag1
Ab
Ag2
Ab
5. 电泳约1h
目 录 末页
对流免疫电泳
目 录 末页
沉淀反应分类
1.单向琼脂扩散 2.火箭电泳 3.双向琼脂扩散 4.对流免疫电泳 5.免疫电泳
目 录 末页
免疫电泳
目 录 末页
特点： 1.需仪器 2.灵敏度提高约为：10μg/ml 3.1h能看结果
目 录 末页
四、对流免疫电泳
【原理】
在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗 体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用，抗原向 正极移动，抗体向负极移动，两者相向移动，在 两孔之间相遇，在比例合适处形成沉淀线。
目 录 末页

沉淀反应2


（2）方法评价
可用自动化仪器测定 反应时间较长 检测灵敏度在微克（μ g/l）水平 灵敏度高于透射比浊法
2.速率散射比浊法
速率散射比浊法是一种先进的动力学 测定法，1977年由Sternberg首 先用于免疫学测定。 所谓速率是指单位时间内抗原与抗体 反应的速度。
抗原与抗体结合形成免疫复合物的速 度，在每个单位时间内是不相同的， 在抗体过量的情况下，随着抗原量的 增加，反应速度越来越快，免疫复合 物的总量也迅速增加，出现峰值所需 时间逐渐缩短。
（1）技术要点
终点散射比浊法需减去本底值 因抗原抗体反应的初期极不稳 定，在极短时间内反应介质中散射信 号变动大，以此时获取的峰值计算出 的结果会产生一定的误差。
检测分两个时间进行：在抗原抗体预 反应时段，加入少量样本与抗体反应， 几秒钟后测定第一次散射光信号值 （本底值）；然后加入全量待检样本， 2min后第二次测定散射光信号值， 以第二次信号值减去第一次信号值， 从而获得待测抗原与抗体反应后形成 的复合物颗粒产生的信号峰值，经处 理后转换为待测抗原浓度
二 、散射免疫比浊法
1967年， Ritchie等利用激光照 射液相中抗原-抗体复合物微粒时， 部分光线发生散射的原理，通过测量 散射光的强度来得知待测抗原的量， 称为散射比浊法。
1977年， Sternberg进一步发展 建立了速率散射比浊法，使微量抗原 的定量测定得以快速灵敏地进行。
量化的要求。
（一）原理
将抗体吸附在大小适中、均匀一致的 胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时， 则使乳胶颗粒发生凝集。单个胶乳颗 粒在入射光波长之内不阻碍光线透过， 两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，则 使透过光减少，这种减少的程度与胶 乳凝集的程度呈正比，当然也与待测 抗原量呈正比。

实验二 沉淀试验


鸡传染性法式囊病毒琼脂免疫扩散试验；
三、实验步骤
吸取3-5ml加热融化（含有8％氯化钠） 琼脂平板的配制 1％的琼脂，浇注在干净载玻片上，待 凝固后使用。 用直径为4mm左右的打孔器在琼脂上打出个 打孔 梅花孔，中间孔与周围孔距离为3mm左右， 挑取孔中琼板背面放到火焰上轻轻灼烧，用手背 感觉微烫即可！ 在中央孔加入抗原，周围孔分别加入标准阴 阳性血清，以及被检血清。 加毕后，将琼脂板平放入铺有数层湿纱布的 带盖搪瓷盘内，置37℃条件下孵育，作用24 －48小时，观察结果。
实验七 沉淀试验
一 实验原理： 可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料 浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多 糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后， 在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色 絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称 为沉淀反应。 沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮 状沉淀反应和琼脂扩散反应。
二实验内容：
结果判定： 抗原孔与标准阳性血清之间出现白色沉淀 线，与阴性血清无沉淀线。 抗原与检测血清间出现沉淀线为阳性， 否则为阴性
实验分析讨论：
1、记录实验结果，分析产生结果的原因。 2、请思考在琼脂扩散试验中哪些因素会对结 果产生影响。
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B
B
A
A抗体中针对B抗原 的抗体可以 跨越透过C抗原来自BCA
二、双向琼脂扩散试验
实验材料：
1、鸡传染性法氏囊病毒标准抗原； 2、鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清； 3、待检血清：来自受检鸡的新鲜血清； 4、平皿（Φ6cm）、打孔器、微量加样器等；
二、双向琼脂扩散试验
5、琼脂凝胶板： 将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装
入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿 内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝 固后按如下图方式打孔。 注意:孔间距为孔的直径大小,打孔完毕要封底）
二、双向琼脂扩散试验
实验步骤：
中间孔加标准抗原， 外周孔加被检血清及阳性 血清（如要测被检血清的 效价，外周孔可倍比稀释 后依次加入）。加样后盖 上皿盖，37℃扩散24小时， 观察结果。
实验二 沉淀反应
一、环状沉淀反应 二、双向琼脂扩散试验
一、环状沉淀反应
目的：以炭疽环状沉淀反应为例，掌握 沉淀反应原理、操作方法及结果 的判定方法。
原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如 果二者相应，则可在抗原、抗体两 液接触界面形成白色的沉淀环。
一、环状沉淀反应
实验材料：
1．被检抗原（沉淀原）的制备： （1）热浸法 取可疑材料约1克，研碎，加入510mL生理盐水混合，转至试管内，煮沸30min，取出 冷却，用滤纸过滤，滤液即为被检的沉淀原。 （2）冷浸法 取疑为炭疽的皮革和兽毛，高压灭 菌后，取1cm2或兽毛数克浸于5-10倍的0.5%石炭酸生 理盐水中，4℃浸渍18-24小时，同上法过滤。
原理：
可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼 脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相 遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处 形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于 组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而对其它 的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种 AgAb系统的沉淀物。
性 对 照
静 置 5 － 10
结 果 观 察
2/3高度处即可。
一、环状沉淀反应
试验组
阳性对照组 阴性对照组
一、环状沉淀反应
结果判定：
两液面交界处出现清晰、致密 如线的白轮，是炭疽阳性。 无此现象为炭疽阴性。
二、双向琼脂扩散试验
目的：掌握双向琼脂扩散试验的原理、
操作方法及结果判定方法。
二、双向琼脂扩散试验
阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。
作业：
完成实验报告，画出你所观察到的 沉淀线，并对其进行简要说明。
一、环状沉淀反应
2．炭疽标准抗原 3、炭疽阴性抗原（健康组织浸出液） 4．阳性、阴性炭疽沉淀素血清 5．毛细吸管
沉淀反应管（Φ 0.3-0.4cm ）
一、环状沉淀反应
用毛细吸管吸取炭疽沉淀
素，插入沉淀反应管底部， 设
实 验
缓慢注入到距管底的1/3 处。
阳 性 、
步 骤
阴
min
用另一支毛细吸管吸取被检 材料，插入离沉淀管底近1/3 处，沿管壁缓慢加入到沉淀 素的上面，边注边提使达到
Ag
生理
?
盐水
Ab
带现象（zone phenomenon）
一种抗原-抗体反应的现象。在凝集反应或沉淀 反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗 体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉 眼可见的反应现象。
抗体过剩：前带现象；
抗原过剩：后带现象。
二、双向琼脂扩散试验
结果判断：
阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时， 受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与 阳性对照沉淀线融合。