蛋白质含量测定法(Bradford法)标准操作规程SOP

实验一Bradford法测定蛋白质浓度1.目的：练习标准曲线的制作，比较不同pH值的蛋白质标准溶液对测定的影响。

2.试剂：①显色剂：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%（w/v）磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。

②BSA标准溶液（1000µg/ml），分别用0.01N盐酸，去离子水，0.01N NaOH溶液配制，4℃冰箱放置可保存一周。

3.设备与仪器：微量注射器：一支用于专吸BSA；一支用于专吸dH2O岛津UV-265紫外可见光分光光度计4.操作程序：试管号 1 2 3 4 5 6BSA（µl）0 10 20 40 70 100去离子水（µl）100 90 80 60 30 0显色剂（ml） 5 5 5 5 5 5加显色剂混匀，静止2min后测定OD595，建立标准曲线注：①显色液中G-250，出现沉淀不能用。

②定容BSA标准液时，混合次数，以保证混匀。

实验二蛋白质的浓缩（PEG法）1.原理干PEG粉末吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。

PEG吸收水分的速度很快，为防止PEG进入蛋白质溶液，最好选用分子量大的PEG。

一般用分子量为20000的PEG。

2.试剂与设备牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇（PEG），玻璃纸，岛津UV-265紫外可见光分光光度计3.操作将一定浓度的BSA溶液20mL放入具有半透膜性质的方形玻璃纸中，用细线扎住口，放入盛有PEG干粉的培养皿中，让盛有BSA溶液的玻璃纸外周涂上PEG；当玻璃纸上的PEG干粉湿透后，抹去PEG，如此反复几次，就可达到浓缩的效果。

当样品浓缩至少于3mL时，进行OD280测值。

4.结果可直接比较浓缩前后OD值的变化；也可制作一个标准曲线，定量描述蛋白质浓度的变化。

表蛋白质浓度的标准曲线管号 1 2 3 4 5 标准BSA溶液（mL） 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL） 4 3 2 1 0 蛋白质浓度（mg/mL）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ABS280标准BSA溶液的浓度为1mg/mL5.计算求回归方程，并利用该方程计算浓缩前后浓度的变化。

Bradford法测蛋白浓度一、考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G─250 20mg溶于9.5mL乙醇中，加入17mL 磷酸和173.5ml蒸馏水。

二、标准和待测蛋白质溶液1．标准蛋白质溶液IFN-r紫外扫描定量，用0.15mol/L NaCl配制成1OD280/mL蛋白溶液。

2．待测蛋白质溶液。

DH5a 菌体蛋白和XL－Blue菌体蛋白，使用前用0.15mol/L NaCl稀释。

三、器材DU800四、操作方法1.制作标准曲线取7支离心管，按下表平行操作。

试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.06 0.15mol/L NaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm测定结果如下：蛋白量（ug）580nm 1 580nm 2 580nm平均595nm 1 595nm 2595nm平均10 0.0814 0.0755 0.07845 0.0709 0.0671 0.06920 0.2335 0.2288 0.23115 0.2144 0.2188 0.216630 0.32 0.285 0.3025 0.307 0.2661 0.2865540 0.372 0.389 0.3805 0.3537 0.372 0.3628550 0.443 0.4927 0.46785 0.4196 0.4751 0.4473560 0.6408 0.528 0.5844 0.6224 0.5079 0.56515 实验过程中发现，蛋白与G-250混合后，吸收值不稳定，随时间变化。

2.扫描测试实验1）加20ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min ，结果：吸收值随时间逐渐下降，图谱名称:20110321 20 ug2）加60ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min，结果：吸收值随时间逐渐下降，10——20min时变化幅度较小，图谱名称:20110321 60ug3）加40ug IFN-r扫描，混合后400——700nm波长扫描，分别在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min时扫描，595nm吸收值随时间逐渐下降，450nm吸收值变化很小，变化值约0.001。

蛋⽩质含量测定法（Bradford法）标准操作规程SOP审批页⽬录1⽬的 (4)2范围 (4)3定义 (4)4环境、健康和安全 (4)5培训 (4)6职责 (4)7程序（内容） (4)7.1原理 (4)7.2实验材料 (4)7.3操作步骤 (5)7.4结果计算 (5)7.5判定标准 (6)7.6注意事项 (6)8相关⽂件 (6)9参考⽂献 (6)10流程图 (6)11附录 (6)蛋⽩质含量（Bradford法）测定记录 (1)蛋⽩质含量（Bradford法）测定记录(适⽤于多个样品) (1)1⽬的规范蛋⽩质含量检测（Bradford法）的操作过程。

2范围本规程适⽤于样品中蛋⽩质含量的检测（Bradford法）。

3定义————4环境、健康和安全————5培训5.1培训部门：分析研究部。

5.2培训对象：分析研究部相关⼈员。

5.3培训⽅式和时数：⾃学，1⼩时。

5.4考核⽅式：问答。

6职责6.1质量保证部：负责监督本⽂件的执⾏。

6.2分析研究部：负责严格执⾏本规程规定。

7程序（内容）7.1原理本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋⽩质分⼦中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳⾹族氨基酸结合形成蓝⾊复合物，该蓝⾊复合物在595nm处有最⼤吸收值，在⼀定浓度范围内其颜⾊深浅与蛋⽩质浓度呈正⽐，以蛋⽩质对照品溶液作标准曲线，采⽤⽐⾊法测定供试品中蛋⽩质的含量。

7.2实验材料7.2.1试药与试液7.2.1.1超纯⽔：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本⽅法所有试液均⽤超纯⽔配制。

7.2.1.2酸性染⾊液：（1）⾃配：称取0.l0g考马斯亮蓝G250，加⼄醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加⽔稀释⾄1000ml，混匀。

滤过，取滤液，即得。

本试剂置棕⾊瓶内避光保存，如有沉淀产⽣，使⽤前再滤过，2～8℃保存6个⽉。

（2）购买商品化试剂：如Quick Start TM Bradford 1X Dye Reagent，Cat#500-0205，⼚家BIO-RAD。

蛋白质含量测定操作细则1．试剂与器材：1．1标准蛋白溶液（100μg/ml），经事先标定。

1．2酚试剂：酚试剂贮备液（购买国产或进口）经标准氢氧化钠液滴定，测定酸浓度，用注射用水稀释至1M，即为酚试剂。

1．3 2%酒石酸钠溶液：称取2克酒石酸钠，加注射用水溶解至100ml。

1．4 1%硫酸铜溶液：称取1克硫酸铜，加注射用水溶解至100ml。

1．5 4%碳酸钠溶液：称取4克碳酸钠，加注射用水溶解至100ml。

1．6 0.8%氢氧化钠溶液：称取0.8克氢氧化钠，加注射用水溶解至100ml。

1．7 碱性铜液（用时现配）取试剂1. 3、1. 4各0.5ml，试剂1. 5、1. 6各25ml，混匀。

1．8 分光光度计（有650nm波长）1．9 计算器：CASIO fx－3900 （能计算相关系数）1．10电子天平1．11试剂瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、洗耳球、滤纸等1．12吸管、移液管、中试管、试管架2．操作：2．1标准曲线：精确量取标准蛋白液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别加入试管中，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm波长比色，测定其OD值，计算相关系数。

2．2样品测定：精确量取适量样品（蛋白约为50μg）于试管内，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm 波长比色，测定其OD值，（显色后，若浑浊，经3000rpm离心后再比色）。

3．结果计算：3．1坐标法以蛋白浓度为横坐标，测定的OD值为纵坐标，作一标准曲线，根据样品的OD值从标准曲线上查出相应的结果（μg），进行计算。

查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量×10×固总3．2计算器法：3．2．1按AC键，打开计算器开关。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。

如核糖核酸酶或溶菌酶。

去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。

如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。

如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。

通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。

染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。

注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。

注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。

待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。

适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。

当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。

在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

Bradford法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。

Bradford法测蛋白质含量标准操作规程Bradford法检测蛋白质含量1.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

2.器皿与耗品：所有玻璃器皿为清洁级，37度烤干。

tube、tip：一次性使用，容量瓶，96孔酶标板，3.仪器设备：酶标仪：旋涡混匀器。

4.溶液的配置：4.1.G250储存液：95%无水乙醇：100ml88%磷酸：200 ml考马斯量兰G250：350mg室温下可长期保存，稳定。

4.2.G250工作液：双蒸水：425ml95%无水乙醇：15 ml88%磷酸：30 mlG250储存液：30 ml可根据体积相应缩小比例配制，用1号滤纸过滤并保存于室温棕色瓶中，可使用数周。

6.3牛血清白蛋白标准品BSA(实验室购买).配制标准品标准程序：将牛血清白蛋白配制成1mg/ml，取牛血清白蛋白100mg，先用超纯水溶解，待其溶解后定容到一个洁净的100ml容量瓶中，300ul分装，保存于-20度，使用时，将其稀释至200ug/ml，配制标准品备用。

4.3.标准品的鉴定用原有的标准品做标准曲线，随机取三支本分装品为样品，测定样品蛋白含量，得X ±SD（其中X 单位为ug/ml）与RSD, 当X值为98-102，且RSD值小于等于2%者，认为该标准品的标示浓度为200ug/ml。

lBradford法测蛋白质含量标准操作规程5.程序：5.1.样品的处理5.1.1.一次检测过程包括标准不能超过20个样品。

若是原液或成品, 每个样品需做2个或3个稀释度：V水＝V原（d－1）其中V水为需要加入纯化水的体积，V原为稀释前样品的体积，d为稀释度5.1.2.待测样品如为冻干品，则根据标示量稀释至1mg/ml，再稀释10倍；待测样品如为未知浓度的样品，可以根据bradford标准品颜色目测后稀释样品。

5.1.3.待测样品均需溶解后先离心，再进行稀释和检测操作。

5.1.4.稀释后的样品需做同样的三个反应体系。

Bradford法测定蛋白含量，建立标曲（分光光度计）。

实验原理：考马斯亮蓝G—250染色液可以与蛋白质上特定结构相结合形成复合物，其最大光吸收峰值也由465nm变为595nm，并且在一定浓度范围内，反应液复合物在595nm处吸光度的变化值与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加值即可测定蛋白含量，建立标曲。

该法测定蛋白浓度的灵敏范围是25μl/ml-200μl/ml。

实验试剂：㈠：考马斯亮兰—G250染色液㈡：牛血清白蛋白㈢：超纯水㈣：无水乙醇实验仪器：㈠：移液器2-20μl PIPETMAN20-100μl PIPETMAN1000μl eppendorf㈡：移液枪头AxyGen㈢：离心管18只 1.5ml AxyGen㈣：分光光度计BIO-RAD Smartspec 3000㈤：漩涡混匀器㈥：比色皿㈦：离心管架实验步骤：㈠：Bsa（5mg/ml）4°c解冻，考马斯亮兰染色液常温放置20分钟㈡：取50μl Bsa加入1.5ml离心管，加超纯水450μl配成0.5mg/mlBsa标准溶液500μl㈢：由于bradford法测蛋白浓度的灵敏范围是25μl/ml-200μl/ml，所以分别取25μl/ml、75μl/ml、125μl/ml、175μl/ml、200μl/ml五个浓度值。

㈣：去六只离心管分别编号0、1、2、3、4、5，按下表配置溶液。

㈤：做三组平行组㈥：加样漩涡混匀，静置2-3分钟㈦：设置分光光度计的光吸收值于595nm处，以空白组（0组）为对照测另五组光吸收值（od值），以每个浓度点的离心管为一组（平行3只）建立标曲。

备注：染色液2-8°c保存，标准蛋白-20°c保存，有效期一年。

蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程SOP蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程文件编码：SOPXXXX目录1. 目的 (1)2. 范围 (1)3. 职责 (1)4. 依据 (1)5. 定义 (1)6. 内容 (1)6.1. 原理 (1)6.2. 实验材料 (1)6.3. 操作步骤 (2)6.4. 结果计算 (3)6.5. 判定标准 (4)6.6. 注意事项 (4)7. 相关文件 (5)8. 附件 (5)9. 变更历史 (5)1.目的1.1.规范蛋白质含量检测（BCA法）的操作过程。

2.范围2.1.本规程适用于BF02及其它适合于BCA法的样品（原液或成品）的蛋白质含量测定。

3.职责3.1.方法学研究员负责严格执行本规程规定；3.2.方法学研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。

4.依据4.1.《中国药典》2015年版，通则0731“蛋白质含量测定法”，第四法2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法（BCA法）5.定义5.1.BCA：2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法5.2.BSA：牛血清白蛋白5.3.TCA：三氯乙酸5.4.EDTA：乙二胺四乙酸5.5.EGTA：乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸5.6.DTT：二硫苏糖醇6.内容6.1.原理依据蛋白分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸（BCA）与Cu+结合形成紫色复合物，该复合物在562nm处有最大吸收值。

在一定浓度范围内，其溶液颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液（BSA）作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

6.2.实验材料6.2.1. 试药与试液6.2.1.1. 超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm ，本方法所有试液均用超纯水配制。

6.2.1.2. 铜-BCA 试液：取2, 2'-联喹啉-4，4'-二羧酸钠l.0g ，无水碳酸钠2.0g ，酒石酸钠0. 16g ，氢氧化钠0. 4 g 与碳酸氢钠0.95g ，加水使溶解成100ml ，调节pH 值至11.25,作为甲液，甲液室温保存不超过6个月；另取4 % 硫酸铜溶液作为乙液，乙液室温保存不超过6个月，临用前取甲液、乙液，按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀后使用。