猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

猪蓝耳病（PRRS ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引山西猪场猪蓝耳病并发猪胸膜肺炎放线杆菌的病毒鉴定及细菌分离鉴定以及治疗方案张小敏，郭 波，段宝敏，冯敬敬，李 嘉，雷向东，陈家锃*（天津渤海农牧产业联合研究院有限公司,天津 300000; 天津瑞普生物技术股份有限公司, 天津 300000)起的一种高度接触性传染性疾病，是一种免疫抑制病，常继发或并发感染猪链球菌、鼻支原体、胸膜肺炎放线杆菌病[1]。

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuro pneumia ， APP)是由胸膜肺炎放线杆菌引起以出血性纤维素性胸膜摘 要：2020年2月份山西某大型规模猪场育肥猪突发呼吸困难，无过多症状表现，即突然死亡，发病率为2%，死亡率1.5%左右。

实验室以病死猪为研究对象，综合死亡猪只脏器病变状况观察，无菌采集病死猪的肺脏、肝脏、脾脏病料，进行RT-PCR 检测猪蓝耳病原；用含1%NAD 和5%胎牛血清的TSA 琼脂培养基进行细菌分离培养和纯化，经形态学鉴定、PCR 鉴定、16SrRNA 基因序列进化树构建等方法，结果显示：该发病猪群为猪繁殖与呼吸障碍综合征并发猪胸膜肺炎放线杆菌感染。

药敏试验结果显示：该猪胸膜肺炎放线杆菌对安普霉素、硫酸黏菌素、替米考星+氟苯尼考、替米考星+阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋钠+硫酸黏菌素、头孢喹肟、头孢噻呋钠+新霉素、替米考星+头孢噻呋钠、多西环素+氟苯尼考、头孢噻呋钠+阿莫西林、阿莫西林+克拉维酸钾、头孢噻呋钠+恩诺沙星、新霉素、头孢噻呋钠、安普霉素+头孢噻呋钠敏感。

对恩诺沙星耐药。

本实验室根据临床及检测结果制定治疗方案，为该猪场的猪繁殖与呼吸障碍综合征并发猪胸膜肺炎的临床诊断及用药提供了理论依据。

关键词：猪；猪繁殖与呼吸障碍综合征；胸膜肺炎放线杆菌；分离鉴定；药敏试验Virus identification and bacterial identifcation and isolation and Treatment of PRRS with APP in a pig farm of Shanxi provinceXiaomin Zhang; Bo Guo; Baomin Duan; Jingjing Feng; Jia Lee; Xiangdong Lei; Jiazeng Chen *(Tianjin Bohai Sea United Research Institute of Agriculture and Animal Husbandry Co. , Ltd. , Tianjin 300000, China; Tianjin Ruipu Biotechnology Co. , Ltd. , Tianjin 300000, China)Abstract: Fattening pigs in a large-scale farm in Shanxi developed sudden respiratory disease, without excessive symptoms and died suddenly in February . The incidence rate was 2% and the mortality rate was about 1.5%. In our laboratory, the diseased pigs were selected as the research objects, and the pathological changes of the organs were observed. Lung, liver and spleen samples were collected from the dead pigs. The bacteria were isolated, cultured and purified on TSA Agar medium containing 1% NAD and 5% fetal bovine serum (FBS). The results were obtained by morphological identification, PCR identification and construction of phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence, it was PRRS complicated with APP infection. The results of the drug sensitivity test showed that, this actinobacillus pleuropneumoniae is sensitive to Apramycin, colistin sulfate, tilmicosin + Florfenicol, Amoxicillin, Florfenicol, cefotifuroxime sodium + colistin sulfate, cefquinome, cefotaxime sodium + Neomycin, tilmicosin + cefuroxime sodium, doxycycline + Florfenicol, ceftiofur sodium + Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanate, cefuroxime sodium + Enrofloxacin, neomycin, cefuroxime sodium, Apramycin + Cefuroxime sodium. It is resistant to Enrofloxacin. According to the clinical and test results, the treatment plan was made in our laboratory, which provided the theoretical basis for the clinical diagnosis and medication of PRRS complicated with porcine APP .Key words: Pig; PRRS; APP; Dsolation and identification; Drug sensitivity test作者简介：张小敏（1989-）,女,本科,研究方向为疫病诊断与流行病学调查,183****************通信作者：陈家锃(1985-),男,高级兽医师,博士,主要从事动物疫病监测及流行病学调查,**************肺炎为病理特征的一种高度接触传染性呼吸道传染病，能引起猪急性纤维素性胸膜肺炎或慢性局灶性坏死性肺炎。

猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断摘要:采用生化试验､间接血凝试验对送检的疑似猪传染性胸膜肺炎病猪的病料及血清进行诊断和药敏试验｡结果表明,从病猪肺脏中分离到1株疑似胸膜肺炎放线杆菌,其革兰氏染色为阴性球杆菌,在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不能生长,在TSA平板上形成不透明的淡灰色､湿润､光滑､表面隆起的菌落,血凝试验为阳性,确定所分离菌为胸膜肺炎放线杆菌｡同时对该猪群随机抽检12份血样,用猪胸膜肺炎间接血凝试剂盒检测胸膜肺炎抗体,其阳性率为8.3%｡药敏试验表明,磺胺间甲氧嘧啶钠和长效痢清为敏感药物｡关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;细菌分离鉴定;血凝试验;药敏试验The Laboratory Diagnosis of Porcine Contagious PleuropneumoniaAbstract: The biochemistry test and indirect hemagglutination test were used to check the samples and serum of pigs suspected as porcine contagious pleuropneumonia (PCP) The results indicated that a suspected Actinobacillus pleuropneumoniae was isolated from the pig lung. It was Gram staining negative coccobacillus, and could not grow in ordinary nutrient agar and McConkey＇s agar. It could grow and form a opaque ocean grey, moist, smooth conoly with upheaval at surface in TSA plate; and the hemagglutination test was positive. It was confirmed that the isolated bacterium was Actinobacillus pleuropneumoniae. 12 blood samples were randomly selected and examined by PCP indirect hemagglutination assay kit. The results indicated that the positive ratio of PCP antibody was 8.3%. The result of susceptibility test indicated that sulfamonomethoxine sodium and long-acted Liqing were sensitive drugs.Key words: Actinobacillus pleuropneumoniae; isolation and identification of bacteria; hemagglutination test; susceptibility test猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度传染性的呼吸系统疾病｡该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征,具有较高的发病率和致死率[1]｡随着集约化养猪业的迅猛发展,国家及地区间引种频繁,导致该病的发病率及死亡率大大提高,耐药性问题导致的治疗失败,给世界各地的养猪业带来了极大的经济损失[2,3]｡本试验对河南省新乡市某猪场的发病猪病料进行了细菌分离鉴定､血清学检测及药敏试验,旨在为该病的诊断与治疗提供科学依据｡1材料与方法1.1材料1.1.1试剂麦康凯琼脂培养基､普通营养琼脂培养基､羊鲜血琼脂平板､巧克力琼脂平板､胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)､草酸铵结晶紫､革兰氏碘液､石碳酸复红染液由河南科技学院临床兽医学教研室提供;APP间接血凝抗原､标准阳性血清､标准阴性血清､稀释液由中国农业科学院兰州兽医研究所提供;金黄色葡萄球菌由河南科技学院预防兽医教研室提供;药敏试验所用药物均由河南科技学院兽医院提供｡1.1.2仪器HH.B11恒温培养箱(厦门建红医疗器械厂),75-2型微量振荡器(江苏金坛设备有限公司),OLYMPUS—CH显微镜(Japan),HG101-2A电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)｡1.1.3病料河南新乡市某猪场送检的疑似病猪病料10份及病猪血清2份｡1.2方法1.2.1细菌的分离与培养对病死猪进行病理剖检,观察各个器官的病变｡无菌采取疑似PCP病变肺组织,在TSA培养基上接种培养,观察菌落生长情况,挑取可疑菌落涂片､革兰氏染色､镜检[4]｡1.2.2生化培养特性鉴定将分离到的可疑菌落,分别接种于加入0.01% NAD的羊鲜血琼脂平板､巧克力琼脂平板､麦康凯琼脂平板､普通营养琼脂平板,于37 ℃培养24 h,观察菌落在各个培养基的生长情况｡将可疑菌平行接种布满整个不含V 因子的普通营养琼脂培养基,再在其上垂直划线接种2条金黄色葡萄球菌,37 ℃培养24 h,观察卫星现象｡无菌状态下,用接种针取分离菌纯培养物,分别接种于加有0.01%NAD的生化反应管中,置于培养箱中37 ℃培养24 h,观察其生化特性｡1.2.3间接血凝试验12份抽检血清和被检血样的处理:将送检病猪的血样静置,析出血清,在使用前置于56 ℃水浴锅中灭能30 min,4 ℃保存待检｡APP间接血凝抗原的处理:用灭菌生理盐水10 mL稀释摇匀,1 500 r/min离心10 min,弃上清液,加等量的稀释液摇匀,置4 ℃冰箱24 h后使用｡将冻干标准阳性血清和标准阴性血清按试剂盒说明使用,混匀后作对照｡具体操作步骤参见文献[5]｡判定标准:“++++”表示100%血球凝集,红细胞全部凝集,形成一层均匀的膜,布满整个孔底;“+++”表示75%血球凝集,红细胞在孔底形成一层薄膜,但面积比前者小;“++”表示50%血球凝集,红细胞在孔底形成薄膜凝集,边缘松散或呈锯齿状;“+”表示25%血球凝集,红细胞在孔底呈稀薄散在少量凝集,孔底有小圆点;“-”表示不凝集,红细胞全部沉于孔底,边缘光滑｡以出现50%红细胞凝集的最高稀释倍数判定为该血清的凝集价(效价)[6]｡判定条件:在阳性对照血清滴度不低于1∶128,阴性对照孔血清除第一孔允许存在前滞现象(+)外,其余各孔及稀释液对照孔均为“-”的前提下,对待检血清进行判定,否则重试｡待检血清的判定标准:检测血清抗体效价≥1∶8判为阳性,效价≤1∶4为阴性｡1.2.4药敏试验将分离菌在巧克力琼脂平板上均匀划线接种,按常规纸片法将药敏纸片贴在平板上,置于恒温培养箱24 h,观察并测量抑菌圈的大小,判定不同药物的敏感程度｡判定标准:抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感(+++),直径10~20 mm 为中度敏感(++),直径≤10 mm为低度敏感(+),无抑菌圈为不敏感(-)[7]｡2结果与分析2.1细菌的分离与培养在TSA平板上形成不透明､淡灰色､湿润､光滑､表面隆起的菌落,挑取单个可疑菌落镜检观察,有革兰氏染色呈阴性的小球杆菌｡病理剖检结果:剖检病猪可见其肺脏表面有纤维素性物质附着,并与胸壁和膈肌粘连,胸腔有黄色积液,心包外膜附着有纤维素性物质,心包积液,颌下淋巴结肿大,肝脏和肾脏未见异常｡2.2生化培养结果分离菌株在巧克力琼脂平板上37 ℃培养24 h后,形成湿润､浅灰色隆起､直径0.5~0.8 mm的圆形菌落;在麦康凯和普通营养琼脂平板上不生长;在羊鲜血琼脂平板上有溶血现象｡在靠近金黄色葡萄球菌的地方,可疑菌生长较多,远离划线处则生长较少,表明其对V因子有依赖性｡该菌能发酵葡萄糖､甘露糖､蔗糖､果糖,不能发酵甘露醇,尿素酶试验呈阳性,产生硫化氢气体,靛基质试验呈阴性｡综合以上试验结果,可确定该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌｡2.3血清学诊断结果血清学诊断结果表明,被检病猪的血清抗体效价均大于1∶8,可确定为阳性｡抽检的12份猪血样中,血凝效价在1∶8以上的有1份,在1∶8以下的有11份,其阳性率为8.3%｡2.4药敏试验结果药敏试验结果见表1｡由表1可以看出,该菌对磺胺间甲氧嘧啶钠高敏,对长效痢清中敏,对强效头孢､头孢噻呋､青霉素钾､氨苄青霉素､氟苯尼考､阿莫西林等不敏感｡3讨论引起猪呼吸系统疾病的病原较多,有些胸膜肺炎病原还能激发或伴发其他疾病如巴氏杆菌､副猪嗜血杆菌､猪放线杆菌的感染[5]｡该病的临床症状缺乏特征性,仅靠纤维素性胸膜炎､胸肺粘连等病变不能准确诊断,PCP病例并不一定都表现为纤维素性胸膜肺炎,有的表现为肺部充血､水肿[8]｡因此对猪传染性胸膜肺炎的确诊必须依靠恰当的实验室诊断技术｡APP在生长过程中对营养及环境要求较高｡TSA培养基营养丰富,对于嗜血菌的培养率非常高,现引入到APP的分离培养中,效果很好｡同时,因该菌与其他杂菌混合感染的时候,细菌的分离更加困难,建议选取未经用药的病猪或濒死猪进行分离,其分离率较高,分离时应严格无菌操作,防止杂菌的污染｡本试验采用血凝试剂盒进行检测,结果病死猪的PCP抗体效价均在1∶8以上,该猪群未进行过免疫,说明该猪群感染了APP｡加上各地流行病株的血清型各有差异,没有通用疫苗进行免疫,目前多数猪场仍以药物控制作为预防和治疗的主要手段,但APP易产生耐药性,且部分敏感猪在感染后短时间内发生不可逆转的肺组织病变,因此猪场兽医应对APP的感染情况有充分的认识,必要时可定期分离病原进行体外药敏试验,以便早期进行预防[9]｡参考文献:[1] 吴家强,崔锦鹏, 张秀美, 等. 猪接触传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 畜牧与兽医,2002,34(10):36-39.[2] 张立昌.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 养猪,2001(1):40-42.[3] 陈海平,蔡金洲,张辉,等. 猪嗜血杆菌胸膜肺炎的流行和防制[J].养猪,1995(1):34.[4] 陈小玲,杨旭夫,朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J].中国兽医杂志,2001,37(7):33-35.[5] 姚火春.兽医微生物实验指导[M].北京:中国农业出版社,2001. 30-50.[6] 刘慧芳,刘江梅,余旭平.猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法[J].上海畜牧兽医通讯,2006,25(5):52-53.[7] 蔡宝祥.家畜传染病学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,1996.144-145.[8] 陆承平.兽医微生物学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2001.[9] 王天有,刘保国,赵恒章.猪传染病现代诊断与防治技术[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005.40-179.。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定与药敏试验摘要:从江苏泰州地区疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料,经细菌分离培养得到了3株分离株TZA1､TZA2和TZA3株｡经形态学检查､CAMP试验､生化试验和血清型鉴定,确定TZA1株和TZA2株为血清1型,TZA3株为血清3型｡药敏试验显示,3株分离菌株对恩诺沙星､阿齐霉素､头孢唑肟高度敏感｡关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;血清型鉴定;药敏试验胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是革兰氏阴性､有荚膜的多形球杆菌,有时呈线性,无鞭毛,不运动,不形成芽孢｡根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD,又称V因子),可将APP分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型,生物Ⅰ型为NAD依赖株,包括血清型1~12 型和15 型,生物Ⅱ型的生长不依赖NAD,但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长,含有2个血清型,为血清型13和14[1]｡猪感染APP后的疾病是猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumia,PCP),急性暴发时有很高的发病率和死亡率｡一些病猪康复后常伴有慢性肺炎,导致生长停滞且长期带菌而成为其他猪的传染源,此病给养猪业造成较大的经济损失[2]｡本研究从江苏泰州地区部分规模猪场临床表现为胸膜肺炎的病料中进行病原分离和血清型鉴定,并对分离菌株进行药敏试验,以期为泰州地区猪传染性胸膜肺炎的防控､净化提供理论支撑｡1材料和方法1.1材料PPLO琼脂和NAD购于扬州市广陵区全球通实验用品销售中心;犊牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司;常规培养基､生化试剂和药敏纸片(氟苯尼考和强力霉素为自制)购于杭州天和微生物试剂有限公司;APP 1､3､5､7､9型阳性血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所;金黄色葡萄球菌为本实验室保存;待检病料采集于泰州市规模猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪｡1.2试验方法1.2.1细菌的分离培养与形态观察取死亡猪的气管分泌物和肺脏作涂片,革兰氏染色,镜检;同时取病料接种于含2% NAD的PPLO琼脂平板,在5%~10% CO2条件下,37 ℃培养24 h｡然后挑取可疑菌落涂片,镜p1.2.4药敏试验检测分离菌株对氟苯尼考､强力霉素､复方新诺明､丁胺卡那霉素､恩诺沙星､氨苄西林､头孢唑肟和阿奇霉素8种抗生素的敏感性｡将保存好的菌液(浓度稀释到1.5×108个/mL) 均匀涂布在PPLO琼脂上, 然后将药敏纸片贴在平皿上,培养24 h后观察结果,并按抗菌药物药敏试验判定标准判定分离菌株对不同抗生素的敏感程度[4]｡1.2.5菌株血清型鉴定将纯化培养的分离菌株37 ℃培养24 h,用生理盐水洗下,制成生理盐水细菌悬液｡取1滴APP可疑菌株分别与APP 1､3､5､7､9单因子标准阳性血清均匀混合,按照常规方法进行平板凝集试验,观察结果｡2结果2.1细菌的形态特征病料涂片以及分离纯化菌革兰氏染色､镜检,都可见有革兰氏阴性､多形态的细菌,多为球杆菌､短杆菌､偶有成丝状的细菌,着色不均｡2.2分离菌的培养特性3株分离菌在加入2% NAD的PPLO固体培养基上培养24 h,可见1~2 mm､露珠状､半透明的菌落｡2.3CAMP试验3株分离菌在靠近金黄色葡萄球菌的地方出现明显的溶血区域,即CAMP试验阳性｡2.4生化试验3株分离菌均呈卫星现象,可水解尿素酶,发酵乳糖､果糖､葡糖糖,不发酵甘露醇､山梨醇､鼠李糖及阿拉伯糖｡靛基质､甲基红､V-P试验均为阴性｡硝酸盐还原试验阳性,生长需要NAD｡2.5血清型鉴定TZA1株､TZA2株与APP 1型阳性血清发生强烈的凝集发应,鉴定为血清1型;TZA3株与APP 3型阳性血清发生强烈的凝集发应,鉴定为血清3型｡3株菌株与生理盐水和其他血清型的阳性血清未见凝集现象,结果见表1｡2.6药敏试验TZA1和TZA2株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感｡TZA3对头孢唑肟极度敏感｡3株分离菌对氟苯尼考､丁胺卡那霉素､强力霉素中度敏感,对复方新诺明和氨苄西林低敏,结果见表2｡3小结与讨论3.1APP分离胸膜肺炎放线杆菌营养要求高且受外界影响因素较多,初次比较困难｡在分离的过程中,对于病死猪最好在刚死亡或频临死亡时采集病料,否则,即使病料中有APP感染,也会因猪死亡时间长,致使病料中APP死亡[5]｡应在初次分离培养的培养基中加入NAD,否则APP在常规培养基中大多不生长或生长不良｡本次分离选择加入NAD的PPLO琼脂培养基,成功分离到了3株APP菌株｡3.2APP血清型鉴定胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区流行菌株的血清型有所不同[6]｡研究表明,我国流行的猪传染性胸膜放线杆菌血清型以1型､3型､7型为主[7]｡因此,本试验选用胸膜肺炎放线杆菌标准单因子阳性血清1､3､5､7､9型为鉴定标准,结果从泰州地区规模猪场分离到的3株APP菌株,血清分型试验鉴定TZA1和TZA2为血清1型,TZA3为血清3型｡本次试验基本摸清了泰州地区APP流行菌株的优势血清型,为本地区猪场猪传染性胸膜肺炎的免疫预防奠定了基础｡3.3APP药敏试验药敏试验结果表明,3株分离菌对同种药物的敏感性有较大差异,其中TZA1和TZA2两个分离株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感,而TZA3株对头孢唑肟极度敏感｡本药敏试验筛选出的恩诺沙星､阿奇霉素､头孢唑肟和氟苯尼考可作为治疗本地区PCP的首选药物｡研究表明,多种抗菌药物对该菌的治疗效果不理想[4]｡兽医临床上常选用的氟苯尼考和强力霉素等药物敏感性不高,究其原因可能是这些抗生素的大剂量､不规范使用导致临床上耐药性的产生｡建议规模化猪场在防治PCP时最好通过药敏试验选用敏感度较高的抗生素,以最少的投入获得较大的经济效益｡参考文献:[1] 唐文山,李昕.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 动物医学进展,2008,29(2):98-102.[2] 徐公义,王海丽, 葛长城, 等. 猪传染性胸膜肺炎的诊断与治疗[J].中国畜牧兽医,2008,35(5):106-107.[3] 马晓平,彭广能,曹三杰,等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的初步分离鉴定与诊治体会[J].中国兽医杂志,2008,44(2):75-76.[4] 何启盖,王贵平,刘军发,等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及药敏试验[J].中国预防兽医学报,2003,25(5):360-363.[5] 雷连成,华芳,王丽哲,等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定与毒力测定[J].中国兽医学报,2008,28(4):359-362.[6] 冼琼珍,黄耿森,叶润全,等.血清6型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2007(5):70-72.[7] 逯忠新,柳纪省,赵萍,等. 猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测[J].中国兽医科技,2001,31(3):16-17.[8] 余光勇,郭万柱,徐志文,等.一株四川株猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2008(6):62-64.。