猪放线杆菌病

华中农业大学硕士学位论文猪胸膜肺炎放线杆菌II型毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究Research on identification and function of type Ⅱtoxin-antitoxin system in Actinobacillus pleuropneumoniae 研究生 : 赵席功学号 : 2015302110163指导教师 : 贝为成教授指导小组：周锐教授申邦教授栗绍文副教授王喜亮副教授郑金水副教授专业：预防兽医学研究方向：动物传染病获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2018年6月华中农业大学动物科技与动物医学院二○一八年六月猪胸膜肺炎放线杆菌II型毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究目录摘要 (i)Abstract (ii)缩略词表（Abbreviation） (iv)第1章文献综述 (1)1.1 胸膜肺炎放线杆菌 (1)1.1.1 病原学 (1)1.1.2 流行病学 (2)1.1.3 致病机理 (3)1.1.4 诊断及防治 (5)1.2 毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin system, TAS） (6)1.2.1 毒素-抗毒素系统的研究进展 (6)1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌中的II型TA系统 (7)第2章研究目的与意义 (9)第3章材料和方法 (10)3.1 实验材料 (10)3.1.1 菌株、质粒和培养条件 (10)3.1.2 实验所用酶、试剂和仪器 (15)3.1.3 主要培养基及抗生素配制 (15)3.1.4 主要溶液的配制 (16)3.1.5 引物 (17)3.1.6 实验动物 (19)3.2 实验方法 (20)3.2.1 生物信息学预测分析 (20)3.2.2 TA系统的共转录分析 (20)3.2.3 验证毒素的作用 (21)3.2.4 毒素的杀菌作用 (24)3.2.5 验证抗毒素的作用 (25)3.2.6 毒素抗毒素的相互作用 (25)3.2.7 大肠杆菌WM3064和β2155感受态细胞的制备 (26)3.2.8 抗毒素对TA操纵子的自动调节 (27)3.2.9 TA系统在APP各血清型中的分布 (29)3.2.10 突变株的构建与鉴定 (29)3.2.11 胸膜肺炎放线杆菌电转化感受态制备及电转化 (30)3.2.12 互补菌株的构建与鉴定 (31)3.2.13 突变株与互补菌株生物学特性 (31)第4章结果与分析 (33)4.1 猪胸膜肺炎放线杆菌TA系统的预测 (33)4.2 TA系统共转录分析 (33)4.3毒素在大肠杆菌生长中的毒性作用 (34)4.4抗毒素作用的评估 (36)4.5毒素抗毒素的相互作用 (37)4.6抗毒素对TA操纵子的自动调节作用 (38)华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文4.7 TA系统在APP各血清型中的分布 (39)4.8突变株的构建与鉴定 (41)4.9突变株的遗传稳定性 (41)4.10互补菌株的构建与鉴定 (42)4.11互补菌株的遗传稳定性 (43)4.12突变株与互补菌株的生长特性 (43)4.13突变株对小鼠的存活实验 (44)第5章讨论 (45)第6章结论 (47)参考文献 (48)附录 (57)致谢 (58)猪胸膜肺炎放线杆菌II型毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究摘要胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一种能够引起临床上以急性出血和坏死性、慢性纤维素性胸膜肺炎为主要特征的高度接触传染性疾病猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumoniae，PCP）的病原菌，一旦发病，将给国内外养猪业带来很大的经济损失。

警惕猪呼吸道的杀手，放线杆菌胸膜肺炎放线杆菌胸膜肺炎又称传染性胸膜肺炎，是猪的一种严重呼吸道疾病，给养猪生产造成严重经济损失。

该病病原为胸膜肺炎放线杆菌（APP），是呼吸道疾病综合征的主要病原之一。

目前全国很多地区已经进入胸膜肺炎的高发期。

由于伪狂犬病野毒的感染率极高，全国各地猪场胸膜肺炎的发病率居高不下，尤其是在炎热和雨水比较多的季节（气压低），更容易发生。

1.病原体胸膜肺炎放线杆菌是一种革兰氏阴性菌，有两个生物型。

生物Ⅰ型的生长依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是主要的致病型；生物Ⅱ型的生长无需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，致病性弱。

根据细菌荚膜多糖和脂多糖的抗原性可将APP分成15个血清型，其中1、5、9、11和12型通常具有很强毒力，血清型之间交叉反应不明显。

同一猪群可同时感染几种血清型。

APP的毒力因子很多，包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、溶血外毒素、粘附因子和菌毛等，其中溶血外毒素是引起宿主肺部病变的最主要因素。

一种血清型可以分泌一种或两种毒素，但不同血清型也可分泌同一种毒素。

在APP的15个血清型中，目前已发现四种不同的溶血毒素，分别是ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。

前三种是APP致病的主要毒素，具有不同的溶血活性和细胞毒性，也是APP主要的保护性抗原。

2.流行病学和发病机理APP产生的毒素会导致猪肺部严重损伤。

该菌可以感染从断奶到屠宰的各日龄的猪，但通常发生在8至16周龄的猪。

在母猪群当中并不常见，除非母猪从未接触过该病菌（没有免疫力）。

潜伏期非常短，最短可能只有12小时。

3.促进因素3.1一些免疫抑制病如PRRS、PCV2、霉菌毒素中毒等可促进APP的发生；同样一些呼吸道病原体如肺炎支原体、萎缩性鼻炎、猪流感等也会促进APP的发生。

伪狂犬病野毒抗体阳性率高的猪场，胸膜肺炎的发病率高。

3.2环境和管理因素本病的发生受外界因素影响很大，气温剧变、潮湿、通风不良、频繁转群、饲养密集、管理不善等条件下多发，一般无明显季节性。

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种高度接触性、致死性呼吸道传染病，临床上以急性败血症、发热、咳嗽、高度呼吸困难为特征，是被国际公认的危害现代养猪业的重要疫病之一，给集约化养猪业带来了巨大的经济损失；特别是近年来本病的流行呈迅速上升且混合型感染趋势，危害日趋严重，务必引起高度重视。

一、病原与流行病学猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种呼吸道传染病。

APP 是革兰氏阴性、有荚膜的多形球杆菌，迄今已发现两个生物型共15个血清型，其中生物Ⅰ型中的1、5、9、10、11五种血清型致病力最强，生物Ⅱ型中的13和14致病性比生物Ⅰ型要弱。

我国以1、3、7血清型为主，免疫学研究证明，由于主要血清型之间缺乏交叉免疫保护作用，给本病的诊断及疫苗防治带来一定的困难。

不同品种、性别及年龄的猪对该病都有易感性，其中6周龄至5月龄的猪较多发，但以3月龄仔猪最为易感，病猪和带菌猪是本病的传染源。

APP 主要通过空气飞沫传播，在感染猪的鼻汁、扁桃体、支气管和肺脏等部位是病原菌存在的主要场所，病菌随呼吸、咳嗽、喷嚏等途径排出后形成飞沫，通过直接接触而经呼吸道传播；也可通过被病原菌污染的车辆、器具以及饲养人员的衣物等间接接触传播；小啮齿类动物和鸟类也可能传播本病。

该病的发生具有明显的季节性，多发生于4～5月和9～11月，在恶劣气候条件下极易暴发流行；此外，饲养环境突然改变、猪群的转移或混群、拥挤或长途运输、通风不良、密度过大、湿度过高、气温骤变等应激因素，均可引起本病发生或加速疾病传播，使发病率和死亡率增加。

二、流行特点近年来，随着规模化养猪业的兴起，猪传染性胸膜肺炎呈现以下新的流行特点。

1．由于饲养管理条件差，断奶仔猪发病率和死亡率明显增高。

以往虽然仔猪发病率较高，但病情一般不太严重，死亡率也较低，现在仔猪发病率和死亡率都有明显增加的趋势。

特别是不少中小型养殖户，断奶后刚转入保育舍的仔猪，由于饲养管理条件差，在气候突变、分群、变换饲料等产生的应激因素下，极易导致该病的发生，常常造成大批仔猪死亡。

猪传染性胸膜肺炎的流行病学、临床症状及防治措施-养猪技术猪传染性胸膜肺炎又称猪肺疫,是一种接触性传染病.是由于感染胸膜肺炎放线杆菌而导致,主要特征是慢性纤维素性坏死性胸膜炎和急性出血性纤维素性胸膜炎,其中急性病猪通常会发生死亡,慢性病猪往往能够耐过,但会导致生长发育缓慢,在当前生猪养殖产业化、规模化的大环境下,发病率呈现出上升的趋势,严重影响养猪业的发展,必须采取有效防治措施。

下面一起来具体了解一下：猪传染性胸膜肺炎的流行病学、临床症状及防治措施。

1、流行病学病原特性。

胸膜肺炎放线杆菌是引起该病的病原，该菌是一种革兰氏阴性杆菌，不能够自行运动，无法形成芽饱，具有多种形态，具有荚膜，且能够分泌毒素。

存在于病料中的菌体经过染色呈两极着色，经过24～96 h的人工培养能够形成丝状菌。

该菌是一种兼性厌氧菌，能够在10%二氧化碳的环境中长出黏液状的菌落。

细菌培养基中需要添加适量的维生素因子，接种在巧克力琼脂上进行24～48 h培养，能够长出直径1～2 mm的不透明菌落。

接种在牛、羊血液琼脂上，一般会发生溶血。

该菌具有较弱的抵抗力，大多数消毒药都能够将其杀灭，但能够在一定程度上抵抗壮观霉素、林肯霉素等。

传染源与传播途径。

该病的主要传染源是病猪和带菌猪，主要是猪间的直接接触以及排泄污染物等途径进行传播。

病猪主要是在鼻液、支气管以及肺脏存在病菌，通常是从鼻腔排出后，以飞沫的形式通过空气进行传播，在通风较差和拥挤环境能够使其快速传播。

发病特点。

该病的发生具有明显的季节性，通常在4～5月份和9～11月份发生。

在发生应激，如气候突变、饲养密度过大、饲养环境突然发生改变、通风较差以及长途运输等，都能够引发该病，因此也可叫做“运输病”。

另外，该病在临床上往往会混合感染副猪嗜血杆菌病、猪地方性肺炎等，促使病情加重。

2、临床症状及病理变化病猪表现出体温明显升高，能够达到大约41.5℃，精神萎靡，呼吸困难，鼻、耳、腹部皮肤发绀，呆立不动或者呈犬坐姿势，尿液呈黄色，病程后期发生便秘，临死前有大量混杂血色泡沫的液体从口、鼻中流出。

猪的几种常见细菌性疾病随着生猪养殖的集约化、规模化程度的不断加大，猪群疾病问题也越来越复杂。

因此，疾病的诊断和防治越发显示出它的重要性，但是在这个过程中，我们有相当一部分兽医工作者，在疾病的诊断中重视病毒性疾病，而往往忽视细菌性疾病。

这就导致在使用了大量的抗病毒药物后，猪的疾病仍然没见好转。

针对这种情况，本文着重介绍猪的几种常见细菌性疾病，希望在临床诊断中加以留意和重视。

猪李氏杆菌病猪副嗜血杆菌病，猪链球菌病，猪巴氏杆菌病（猪肺疫）、仔猪副伤寒、仔猪黄痢、白痢、猪水肿病、猪丹毒、猪传染性胸膜肺炎、猪梭菌性胃肠炎、猪渗出性皮炎随着生猪养殖的集约化、规模化程度的不断加大，猪群疾病问题也越来越复杂。

因此，疾病的诊断和防治越发显示出它的重要性，但是在这个过程中，我们有相当一部分兽医工作者，在疾病的诊断中重视病毒性疾病，而往往忽视细菌性疾病。

这就导致在使用了大量的抗病毒药物后，猪的疾病仍然没见好转。

针对这种情况，本文着重介绍猪的几种常见细菌性疾病，希望在临床诊断中加以留意和重视。

一、猪链球菌病猪链球菌病是由不同群的链球菌引起的一种急性高热性传染病。

猪链球菌分α型和β型，α型为草绿色链球菌，致病力较弱，β型为溶血性链球菌，致病力较强，常引起人和动物多种疾病。

人类感染虽少，但是严重。

人感染链球菌的直接因素为屠宰和加工病死猪，本菌对热和普通消毒药抵抗力不强。

临床上该病以败血症，脑膜炎、关节炎及化脓性淋巴结炎为特征。

流行特点是仔猪以败血型和脑膜炎型为主，中、大猪以关节炎型为主，一年四季均可发病，传播迅速，死亡率高。

猪链球菌病的病情复杂，流行情况无特征，有的根据临床症状和病理变化可做出初步诊断，有的还需实验室检查。

该病在诊断时要和急性猪丹毒、猪瘟、猪李氏杆菌病等相区分。

二、猪巴氏杆菌病（猪肺疫）又名猪肺疫、锁喉风或肿脖子瘟，是猪的一种急性细菌性传染病，本细菌对外界抵抗力不强，在日光和高温下立即死亡，1%火碱等消毒药可迅速将其杀死。

猪传染性胸膜肺炎的鉴别从流行病学上进行鉴别猪传染性胸膜肺炎：由胸膜肺炎放线杆菌引起，接触性空气传染，各种年龄的猪均易感，以6周至6月龄猪较多发，时间上4-5月和911月多发，饲养与环境不良因素可以诱发，发病率与病死率变化很大。

高致病性猪蓝耳病：由猪蓝耳病病毒(PRRSV)的变异株所引起，呈多路径、高度接触性传染，不分大小公母，一年四季都可发病，以高温高湿季节等恶劣气候条件下易发。

猪弓形体病：由弓形虫引起的一种人畜共患病，主要侵害35月龄猪，一年四季均可发病，秋冬和早春发病率最高，患病动物和带虫动物的唾液、痰、粪便、尿、乳汁、蛋、腹腔液、眼分泌物、肉、内脏淋巴结、流产胎儿等都重要的传染源，猫和鼠类动物是天然的疫源。

急性猪肺疫：由多杀性巴氏杆菌引起，通过消化道、呼吸道感染，常散发于气候多变、潮湿多雨季节，环境与管理不良因素可以诱发，不论大小猪均可发病，尤以小猪与中猪多发。

猪气喘病：由猪肺炎支原体引起，为高度接触性、慢性呼吸道疾病，不同年龄、性别和品种生猪都可发病，发病率高，病死率低;但在新发生本病的地方其发病率和死亡率都比较高。

本病广泛存在，在饲养管理条件不良、猪只抵抗力降低、气候多变、潮湿雨季易季节多发，以断奶后仔猪最易发病，猪丹毒：由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性传染病，分为急性败血型、亚急性疹块型和慢性型，不同品种、不同年龄的猪一年四季均可发病猪副嗜血杆菌病：由猪副猪嗜血杆菌引起，主要通过空气直接接触感染，其他途径如消化道等也可感染，患病猪或带菌猪(细菌存在于鼻腔上呼吸道内)是传染源;仔猪易感，尤其是断乳后10天左右易发病，年龄越小越易感;可以影响从2周龄的乳仔猪到4月龄的育肥猪，多见于5周-8周龄的猪，发病率一般在 10%一30%，严重时死亡率高达50%。

从临床症状上进行鉴别猪传染性胸膜肺炎：最急性型突然发病，出现高热，体温41.5℃以上。

病初短时轻度腹泻和呕吐，后期呼吸高度困难，呈犬坐姿势，口鼻流泡沫样淡血色分泌物，耳鼻四肢呈蓝紫色，很决死亡;急性型体温升高到40.5℃-41.5 C，沉郁、不食、呼吸困难，张口、呈犬坐呼吸，1日-2日死亡。

16．猪接触传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）猪接触传染性胸膜肺炎，又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征，急性者病死率高，慢性者常能耐过。

本病于1957年由英国的Pattison首次报道。

目前该病在世界广泛存在，造成了巨大的经济损失。

美国、丹麦、瑞士将本病列为主要猪病之一。

我国近年来由于引种频繁，该病也随之侵入，其发生和流行日趋严重，已有多个省市报道了此病。

病原胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP），曾命名为副溶血嗜血杆菌（Haemophilus parahaemolyticus）， Shope和White等人在1964年提出把猪源副溶血嗜血杆菌命名为胸膜肺炎嗜血杆菌（Haemophilus pleuropneumoniae）。

因胸膜肺炎嗜血杆菌与林氏放线杆菌的DNA同源性非常相近，国际细菌分类命名委员会将其更名为胸膜肺炎放线杆菌。

属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus），是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜和菌毛，不形成芽孢，能产生毒素，新鲜病料中呈两极染色，人工培养24～96h可见到丝状菌。

本菌为兼性厌氧，在10%CO2条件下，可长成黏液状菌落。

初次分离时将病料接种于含有50%的小牛血液琼脂上，用葡萄球菌与病料交叉划线，在CO2条件下培养24h，可见在葡萄球菌生长线周围有β溶血小菌落。

目前已报道的有15个血清型，各血清型具有特异性，其血清型特异性取决于荚膜多糖（CP）和菌体脂多糖（LPS）。

但有些血清型有相似的细胞结构或相同的LPS O-链，这可能是造成血清型l、9及11之间，3、6、8之间以及4和7之间有交叉反应的原因。

根据NAD（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称V因子）的依赖性可把15个血清型分为两个生物型。

猪条件性致病菌1、猪放线杆菌主要由猪放线杆菌、驹放线杆菌等致病性放线杆菌引起的疾病。

本病的主要临诊特征为败血症、肺炎、肾炎、关节炎、尿道炎、膀胱炎、输尿管炎等尿道疾病，流产和心内膜炎，患病动物的皮肤、黏膜或其他组织形成明显的肉芽肿或脓肿。

世界上很多养猪国家，如加拿大、荷兰、丹麦、美国等都有报道。

我国也有本病的报道，通常为散发。

临床症状放线菌病暴发，可见在一窝或多窝哺乳仔猪，2～4周龄仔猪突然死亡。

发病猪体温升高(40℃)，皮肤发绀、有出血性淤斑。

发病猪喘气，有时伴有震颤或呈划水样。

肢体远端充血(导致蹄、尾和耳坏死)和关节肿胀。

断奶猪可见厌食、发热、持续性咳嗽和呼吸困难，肺炎。

成年猪暴发此病，死亡率低，可见体温升高，在皮肤上出现圆形或菱形红斑，不食，突然死亡。

母猪可发生乳房炎、脑膜炎和流产2、猪魏氏梭菌猪魏氏梭菌可出现在人畜粪便、土壤、水、和尘埃中，该菌群属典型的条件性致病菌，它可引发地区性流行病，有大量的动物因不同类型魏氏梭菌感染而死亡。

如仔猪坏死性肠炎。

尤其是近年来我国发生家畜猝死症与该菌有关，发病急、病程短、无任何前期症状而突然死亡，而且死亡率极高。

本病常见于1—3日仔猪，1周龄以上仔猪发病率要减少，育肥猪、成年猪多发于90—180日龄，很多病例来不及治疗而死亡，且猪场一旦发生本病不易清除。

临床症状：表现神经症状，乱冲乱撞，转圈，倒地，口流白沫或红色泡沫，四肢划动，全身肌肉颤抖，抽搐，怪叫，呻吟。

呼吸困难。

也有不具任何先兆症状者突然死亡。

粪便呈深绿色或褐色3、铜绿假单胞菌属于假单胞菌属。

因能产生绿色水溶性色素，感染创口时可形成绿色脓液而得名。

又称绿脓假单胞菌，简称绿脓杆菌。

分布广泛。

本菌是条件性致病菌，一般为继发性感染，如大面积烧伤的创面感染、中耳炎、泌尿系统感染，甚至败血症。

对动物能引起猪的坏死性肺炎和坏死性肠炎，水貂和真灰鼠的出血性肺炎和绵羊的“绿毛病”。

在牛的创伤性心包炎、犊白痢、牛乳腺炎和牛不孕症中常可发现本菌。

猪放线杆菌性胸膜肺炎的诊治猪放线杆菌性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种伴有胸膜炎的出血性坏死肺炎，可发生于任何年龄的猪只，呈世界性分布。

目前已有30多个国家和地区报道有该病发生，是国际上公认的危害现代养猪业五大重要传染病之一，尤其在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。

我国该病的发病率有逐年增加的趋势。

江苏省近年来猪放线杆菌性胸膜肺炎时有发生，极大地困扰着养殖户，给养猪业带来了严重的损失。

本文就该病的诊治与预防做一介绍。

一、临诊症状猪只突然发病，体温41～42℃，食欲降低直至废绝；精神沉郁，卧地不起；有短期轻度呕吐和腹泻；咳嗽，张口呼吸，口腔和鼻腔流出大量带血的泡沫样分泌物；呈犬坐姿势，逐渐出现呼吸衰竭；耳、鼻、颈、胸腹、四肢直至全身皮肤发绀。

二、病理变化剖检病死猪只均可见败血症变化；粘膜、浆膜出血，鼻腔、喉头及气管、支气管粘膜充血，内有大量血色气泡；肺充血、肿胀、出血，呈暗红色，切面易碎，间质充满血色胶样液体，肝变明显；可见纤维素性出血性胸膜肺炎，全身淋巴结肿大、充血；心包有淡黄色积液，胸腔内有大量血色液体，胸膜与心包粘连。

三、病原检查分别取病死猪的肺、胸膜及心血触片，经革兰氏染色后镜检，见革兰氏阴性卵圆形两极浓染球杆菌和长丝状菌存在。

四、应对方法该菌对复方新诺明、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺异?f唑、林可霉素、结晶紫、杆菌肽、红霉素、土霉素、卡那霉素高度敏感，用药时可选以上药物。

发病猪群应立即隔离，对死亡猪只进行无害化处理。

清理圈舍，用消毒杀菌药消毒。

对发病猪只每头肌注卡那霉素50万单位、磺胺类药物1支，早晚各1次。

对未发病猪群，圈舍消毒杀菌，对猪只密切观察，如发现有症状猪只，立即进行药物注射、隔离。

发病猪只一般得到两次治疗后，可基本痊愈，再巩固治疗1~2次，均未再发，可停药。

五、体会近几年来，我国各地均有猪放线杆菌性胸膜肺炎的发病报道，本病已成为近一时期危害养猪业的重要传染病之一。