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流式细胞术样本制备

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流式细胞仪的样本制备与数据分析指南

流式细胞仪的样本制备与数据分析指南
流式细胞仪的样本制备与数据分析指南
引言：
流式细胞仪（flow cytometer）是一种广泛应用于生物学、医学研究领域的仪器，能够对单个细胞进行快速、准确的分析和排序。为了获得可靠的实验结果，正确的样本制备和数据分析至关重要。本文将为您介绍流式细胞仪的样本制备和数据分析的基本指南。
一、样本制备
1.细胞准备
3.细胞染色
细胞染色是为了标记细胞内特定的分子或结构，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。常见的细胞染色方法包括荧光染色、酶标记等。在选择染色方法时，需要考虑染色效果、染色稳定性以及对细胞活力的影响。
4.样本预处理
在进行流式细胞仪分析之前，有时需要对样本进行预处理，以消除背景噪音、增强信号等。常见的样本预处理方法包括细胞排序、细胞分选、细胞富集等。
结语：
流式细胞仪的样本制备和数据分析是流式细胞仪实验中至关重要的环节。正确的样本制备和数据分析方法能够提高实验结果的可靠性和准确性，为后续的研究工作提供有力支持。希望本文所提供的指南能够对您的流式细胞仪实验有所帮助。
二、数据分析
ห้องสมุดไป่ตู้1.数据获取
在流式细胞仪实验完成后，需要将得到的原始数据导出到计算机进行后续的数据分析。通常，流式细胞仪会输出FCS（Flow Cytometry Standard）格式的数据文件，其中包含了细胞的荧光强度、散射信号等信息。
2.数据清洗
在进行数据分析之前，需要对原始数据进行清洗，去除噪音、异常数据等。常见的数据清洗方法包括设置门控条件、排除双重tsne等。
3.数据解读
数据解读是流式细胞仪数据分析的核心环节。通过对数据的统计学分析、聚类分析、细胞子群分析等，可以获得关于细胞表型、细胞数量、细胞状态等信息。在数据解读过程中，需要结合实验设计和研究目的，从中提取有意义的结果。

流式细胞术的质量控制

流式细胞术的质量控制

流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。

然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。

本文将探讨流式细胞术的质量控制。

1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。

在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。

对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。

（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。

在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。

（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。

应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。

2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。

为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。

具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。

（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。

（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。

3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。

在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。

（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。

（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。

同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。

4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。

为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。

流式细胞术样品制备技术(完整)

流式细胞术样品制备技术(完整)

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。

因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。

在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。

它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。

尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。

在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。

所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。

目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。

（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。

酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。

常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。

胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。

流式细胞术的原理和应用

流式细胞术的原理和应用

流式细胞术的原理和应用1. 引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术。

通过使用流式细胞仪，可以对生物细胞进行快速、精准的多参数分析，为科学家和医生提供了大量的有关细胞的信息。

流式细胞术已成为生物学领域的重要工具，被广泛应用于细胞分析、免疫表型分析、药物筛选等领域。

2. 原理流式细胞术基于细胞在封闭流动系统中单个通过的原理。

其基本流程包括样本制备、细胞标记、细胞检测和数据分析。

2.1 样本制备样本制备是流式细胞术的第一步，它需要将待检测的细胞样本制备成单细胞悬浮液。

这可以通过细胞培养、组织切片或体液等方式获得细胞样本。

重点是要避免细胞凝聚和聚集，以确保细胞在流式细胞仪中单个通过。

2.2 细胞标记细胞标记是流式细胞术的关键步骤之一。

它使用荧光染料或抗体等标记物与目标细胞发生特异性反应。

荧光染料可以通过不同的通道发出不同波长的荧光信号，从而实现多参数分析。

细胞表面标记的抗体通常与荧光素共价结合，以产生可检测的荧光信号。

同时，可以利用染料进行细胞内部器官或分子的标记，以更详细地研究细胞的功能和结构。

2.3 细胞检测细胞检测是流式细胞术中最关键的步骤之一。

它通过流式细胞仪将标记后的细胞悬浮液以单个细胞的形式通过单个检测区域。

这些细胞在流式细胞仪中被激活并产生荧光信号。

光电传感器将捕获和记录这些荧光信号，并将其转化为数字信号，供数据分析使用。

2.4 数据分析数据分析是流式细胞术的最后一步。

通过对获得的荧光信号的数字化处理，可以获得有关细胞的详细信息，包括细胞表面标记物的表达水平、细胞数量统计、细胞大小等信息。

数据分析可以使用专业的流式细胞仪软件完成，也可以使用其他数据分析软件进行更复杂的数据处理。

3. 应用流式细胞术作为一种全面、高通量的细胞分析技术，广泛应用于各个领域。

3.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中得到了广泛应用。

通过对免疫细胞的表面标记物进行检测，可以评估免疫细胞亚群的数量、功能和表达水平。

流式细胞术的原理和应用

流式细胞术的原理和应用

流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。

流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。

一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。

流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。

2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。

3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。

4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。

二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。

2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。

3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。

4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。

5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。

流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。

流式细胞术基本原理及应用

流式细胞术基本原理及应用

流式细胞术基本原理及应用流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学和临床医学研究的技术，能够快速、高效地分析和计数细胞，同时可以对细胞进行多参数的定位、鉴定和分离。

该技术的原理是通过激光束激发细胞中的荧光染料或标记物，然后检测细胞散射光的强度和荧光信号的强度，进而对细胞进行分析和排序。

本文将介绍流式细胞术的基本原理及其应用。

样本制备是流式细胞术的第一步，通过样本的处理来获取以细胞为基础的单细胞悬浮液。

这个过程可以通过机械或酶的方法破碎组织以获得细胞，并使用缓冲液来稀释细胞以避免细胞团。

通常，通过过滤或离心的方法，除去细胞碎片和大颗粒物质。

然后，用缓冲液沉淀细胞并冲洗细胞以去除细胞外的成分。

细胞悬浮是将细胞从红细胞和组织碎片中剥离并悬浮在缓冲液中的过程。

一种常用的方法是将细胞悬浮在含有胎牛血清等蛋白质的培养基中，以保持细胞的活力和稳定性。

细胞检测是流式细胞术的核心步骤，通过激光光束照射细胞，然后测量散射光和荧光信号来分析细胞的性状。

散射光包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。

FSC反映了细胞的大小和形态，SSC反映了细胞的复杂性和颗粒含量。

荧光信号是通过用具有荧光标记分子（如抗体或染料）标记细胞，然后用激光激发标记物并测量其荧光强度来检测的。

可以使用多个激光器和相应的滤光片来激发和检测多个荧光染料，从而实现多参数的分析。

数据分析是流式细胞术的最后一步，通过计算机软件对测量到的数据进行处理和解读。

数据分析可以根据散射光和荧光信号的特征，将细胞分类和鉴定。

可以根据亮度、大小和形状等参数来区分细胞的不同类型或亚群。

1.免疫细胞学研究：通过荧光标记的抗体，流式细胞术可以用来鉴定和分析细胞表面分子的表达情况和细胞亚群的分布。

例如，用荧光标记的CD4和CD8抗体可以区分T细胞亚群，并研究它们在疾病发展中的作用。

2.细胞周期分析：流式细胞术可以通过荧光染料标记DNA，从而实现对细胞周期的分析。

流式细胞术样本制备.

样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。

直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。

荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。

但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。

还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。

现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。

材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。

流式细胞术样品制备(完整)


一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。

流式样本制备

流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。

它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。

流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。

下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。

对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。

对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。

2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。

常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。

3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。

流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。

4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。

分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。

注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。

- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。

- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。

流式细胞术的原理

流式细胞术的原理流式细胞术是一种用于分析和分选细胞的技术，广泛应用于生物医学研究领域。

它能够快速、准确地分析细胞的表面标记物、内部结构和功能状态，为细胞生物学和免疫学研究提供了重要的手段。

流式细胞术的原理主要包括细胞样本的制备、激发光源的照射、细胞信号的检测和数据分析等步骤。

首先，对于流式细胞术的样本制备非常关键。

细胞样本需要经过胰酶消化、过筛等步骤，获得单细胞悬浮液。

然后，通过离心等手段将细胞沉淀，去除细胞培养基和其他杂质。

接着，将细胞悬浮液进行染色，使细胞表面或内部的标记物与荧光染料结合，以便后续的检测和分析。

其次，流式细胞术需要激发光源的照射。

常用的激发光源包括氩离子激光、氦氖激光等。

这些激发光源能够激发荧光染料发出荧光信号，不同的荧光染料对应不同的波长，因此可以通过选择不同波长的激发光源来激发不同的荧光信号，实现多参数的细胞分析。

然后，流式细胞术通过检测细胞信号来获取细胞的信息。

当细胞悬浮液经过流式细胞仪时，激发光源照射到细胞上，激发荧光染料产生荧光信号，流式细胞仪通过光学系统收集这些信号，并将其转化为电子信号。

这些电子信号经过放大、数字化等处理后，最终被传输到计算机中进行数据分析。

最后，数据分析是流式细胞术的重要步骤。

通过对细胞信号的数据分析，可以得到细胞的表面标记物表达情况、内部结构的特征、细胞的功能状态等信息。

同时，流式细胞术还可以进行细胞的分选，即根据细胞信号的特征，将特定类型的细胞进行分离和收集，为后续的实验研究提供纯净的细胞样本。

综上所述，流式细胞术通过样本制备、激发光源的照射、细胞信号的检测和数据分析等步骤，能够快速、准确地分析和分选细胞，为生物医学研究提供了重要的技术支持。

它在细胞生物学、免疫学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景，对于揭示细胞的生理和病理过程，以及开发新的药物和治疗手段具有重要意义。

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Detergent
Buffer)
Solution B (8mL×1)
(RNase A and trypsin Inhibitor in Spermine
Buffer)
Solution C (8mL ×1)
(Propidium Iodide (PI) in Spermine Buffer)
Buffer Solution (50mL ×3) (DMSO in Sucrose-Sodium Citrate)
8. 在 1 小时内上机
对照：
1. 未染色细胞（全阴） 2. 单染 FITC Annexin V 3. 单染 PI 4. 正常细胞（未经凋亡药物处理）加 AV 和 PI
6-C TBNK 检测
原理：
人类的淋巴细胞按照表面抗原的表达可以被分成三大类：T 细胞（CD3+），B 细胞 （CD19+）和 NK 细胞（Natural Killer 自然杀手）（CD16+CD56+）。这些淋巴细胞表面还会 表达一些其他的抗原。根据这些抗原的表达，我们可以做出对某些疾病的检测和诊断。例 如：CD3+CD4+淋巴细胞的比例和绝对数量是检测 HIV 阶段的重要指标（随着 HIV 的加重， 患者血液中 CD3+CD4+淋巴细胞的数量会逐渐减少）；CD3+CD4+淋巴细胞的比例和绝对数 量以及 T 细胞和 B 细胞的总量也常常是诊断其他免疫缺失疾病和自免疫疾病的依据；表达 CD3-CD16+/CD56+的 NK 细胞往往对某些肿瘤细胞和被病毒感染的细胞有杀伤力，所以其 数量是个体对该症状抵抗力的量化表达。
步骤：
1. 将 10 倍的 Annexin V Binding Buffer 稀释为 1 倍 （将 1 容积的 Buffer 加到 9 容 积的蒸馏水中）
2. 用冷 PBS 把细胞溶液清洗 2 次（离心 1200rpm/5min → 去上清液 → +2mL PBS → 混匀 → 离心 1200rpm/5min → 去上清液 → +2mL PBS→ 混匀离心 → 1200rpm/5min → 去上清液）
Solution A 和 B 在室温下使用（20⁰C-25⁰C），Solution C 要在 2⁰C -8⁰C 下避光保存。
Hale Waihona Puke 步骤：1. 在 200 µL 外周血加入 2mL 裂解液，室温下孵育 10min 2. 将裂解好的外周血离心 1200rpm，5min，去上清液 3. 加入 2mL 鞘液，混匀（如不含红细胞样本无需裂红，从此步骤开始，取 106 细
材料：
被检测细胞 FACS Lysing Solution (细胞裂解液，1 倍或 10 倍，10 倍的要先稀释到 1 倍后使
用)
BD CycletestTM Plus DNA Reagent Kit
(340242)
Solution A (10mL×1)
(Trypsin in Spermine Tetrahydrochloride
样本制备实例：
细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining)
原理：
对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色（DIF）和间接染色（IIF）两种。直接 染色是指用直接联有荧光的抗体染色；而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合，然后 再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测 中使用非常普遍，因为只要采用合适的抗体，几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。 但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同，以及临近通道串色的问题， 多色实验的基本原则是：最强的染料配表达最弱的蛋白，最弱的染料配表达最强的蛋白； 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及 偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、BV605 等为多 色实验提供了更多的选择空间。
对照：
a. 同型对照（和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记：Isotope*3） b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APC c. 单阳 CD8 加 Isotope FITC & APC d. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE
细胞周期 (Cell Cycle)
原理：
3. 将清洗好的细胞加入 1 倍 Annexin V Binding Buffer 中（终浓度 106 细胞/mL） 4. 在 5mL 的流式管中加入 100 µL 步骤 3 的细胞溶液（应含 105 细胞） 5. 在每一管样本溶液中加入 5µL 的 FITC Annexin V 和 5µL 的 PI 6. 将溶液轻轻地震荡后，避光在室温下（25⁰C）孵育 15min 7. 加入 400 µL 1 倍 Annexin V Binding Buffer
2. 在样本中加入 20 µL BD MultitestTM 6-color TBNK 试剂，用移液枪混匀。 3. 避光在室温下孵育 15min。 4. 避免直射光，在样本中加入 450µL 一倍的 FACS lysing solution（裂解液），
细胞在有丝分裂的过程中，核内的 DNA 会进行复制，造成 DNA 含量的波动。如果把 处于 G0/1 期的细胞的 DNA 含量看做 1 倍的话，处于 G2/M 期的细胞的 DNA 含量则为 2 倍。 荧光染料 propidium iodide （PI）是一种核染料。因为每一个 PI 分子只能插在两组相邻的 碱基对中，所以 PI 染料的荧光强度与被染的 DNA 的数量成正比。根据 PI 的这种特性，我 们常常用它来揭示细胞内 DNA 倍性的关系，从而推导出细胞所处的周期。
对照：
1 2
内参：样本内含有已知倍性的细胞亚群 外参（optional）：同类已知倍性的细胞。
细胞凋亡 (Apoptosis)
原理：
细胞程序性死亡/凋亡（apoptosis）是机体移除不需要的细胞的一种常见的机制。 细胞凋亡早期的标记之一是 PS（phosphatidylserine）自胞膜内表面到外表面的转移。 Annexin V （AV）和 PS 有很强的亲和力，所以被荧光标记后常常在流式中被用来检测外翻 的 PS。在细胞凋亡后期，细胞膜常常会破裂。这种现象在流式中可以用 propidium iodide （PI）检测。PI 是一种核染料。当细胞膜完整时，PI 无法穿透胞膜，故无法对细胞核进行 染色。AV 与 PI 共同使用时，可以对细胞凋亡的各个时期进行检测：正常活细胞显示 AV 和 PI 的共阴性；早凋细胞显示 AV 阳性和 PI 阴性；晚凋细胞则显示 AV 和 PI 的双阳性。
10X Annexin V Binding Buffer (50mL×1)
51-66121E
FITC Annexin V (AV) (0.5mL×1)
51-65874X
Propidium Iodide (PI) Staining Solution (2.0mL ×1)
51-66211E
注意： PI 有毒，并具有潜在的致癌性。操作时注意安全，要戴手套。
外周血
BD MultitestTM 6-color TBNK Reagent with BD Trucount Tubes (337166) 或
BD MultitestTM 6-color TBNK Reagent without BD Trucount Tubes (644611)
o CD3 FITC o CD16 & CD56 PE o CD45 PerCP-Cy5.5 o CD4 PE-Cy7 o CD19 APC o CD8 APC-Cy7
注意：Solution A, B, C 中含有 spermine tetrahydrochloride，对皮肤和粘膜有刺激性；
Solution C 中 PI 有毒，并具有潜在的致癌性；
Buffer Solution 中含有 DMSO，具有潜在的致畸性。
操作时戴手套，注意避免眼睛，皮肤和衣服与以上试剂的接触。
2. 避光 15min 3. 在每管中加入 2mL 裂解液，室温下避光孵育 10min 4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm，5min，去上清液
5. 加入 2mL 鞘液，混匀 6. 离心 1200rpm，5min，去上清液 7. 加入 500 µL 鞘液，混匀 8. 3 小时内上机（如果不能立刻上机，2⁰C -8⁰C 避光保存样本）
然而，流式细胞术只能检测在某一时刻穿过激光的细胞的荧光强度，但无法直接判断 在这一时刻到底穿过了几个细胞。如果有细胞粘在一起或是正巧同时穿过激光，流式细胞 仪则会读取其整个荧光强度，从而导致对单个细胞 DNA 含量测定上的误差。为了解决这 个问题，我们常常做一张以 FL2-W 和 FL2-A 分别为横纵坐标的散点图。FL2-W 指的是第二 通道（PI）里该细胞通过时的时间，而 FL2-A 指的是第二通道里该细胞的总荧光强度。当 细胞粘联时，期总体积与质量变大，导致通过激光时间变长，所以 FL2-W 的值会比单个细 胞大出很多。通过这种方式，我们可以将 FL2-W 比较统一（小）的细胞用门圈出，以排除 粘联体，从而确保周期分析的准确性（如下图所示）。然后我们就可以在 FL2-A 的直方图 上直观地对细胞倍性进行分析了。
（T 细胞检测） （NK 细胞检测） （淋巴细胞分群） （T 助细胞检测） （B 细胞检测） （细胞毒性 T 细胞亚群检测）
注意： 试剂中含有叠氮化钠作为防腐剂，请勿吞食。
步骤：
1. 把 50 µL 外周血加入上样管中。（可以使用一般的流式管，也可以是 Trucount 管子。如果使用 Trucount 的管子，则要确保底部的微粒的完整性。 使用 Trucount 可以算比例和绝对计数，使用一般流式管只能算比例）