流式细胞术样本制备

流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。

然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。

本文将探讨流式细胞术的质量控制。

1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。

在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。

对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。

（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。

在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。

（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。

应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。

2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。

为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。

具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。

（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。

（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。

3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。

在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。

（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。

（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。

同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。

4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。

为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。

因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。

在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。

它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。

尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。

在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。

所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。

目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。

（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。

酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。

常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。

胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。

流式细胞术的原理和应用1. 引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术。

通过使用流式细胞仪，可以对生物细胞进行快速、精准的多参数分析，为科学家和医生提供了大量的有关细胞的信息。

流式细胞术已成为生物学领域的重要工具，被广泛应用于细胞分析、免疫表型分析、药物筛选等领域。

2. 原理流式细胞术基于细胞在封闭流动系统中单个通过的原理。

其基本流程包括样本制备、细胞标记、细胞检测和数据分析。

2.1 样本制备样本制备是流式细胞术的第一步，它需要将待检测的细胞样本制备成单细胞悬浮液。

这可以通过细胞培养、组织切片或体液等方式获得细胞样本。

重点是要避免细胞凝聚和聚集，以确保细胞在流式细胞仪中单个通过。

2.2 细胞标记细胞标记是流式细胞术的关键步骤之一。

它使用荧光染料或抗体等标记物与目标细胞发生特异性反应。

荧光染料可以通过不同的通道发出不同波长的荧光信号，从而实现多参数分析。

细胞表面标记的抗体通常与荧光素共价结合，以产生可检测的荧光信号。

同时，可以利用染料进行细胞内部器官或分子的标记，以更详细地研究细胞的功能和结构。

2.3 细胞检测细胞检测是流式细胞术中最关键的步骤之一。

它通过流式细胞仪将标记后的细胞悬浮液以单个细胞的形式通过单个检测区域。

这些细胞在流式细胞仪中被激活并产生荧光信号。

光电传感器将捕获和记录这些荧光信号，并将其转化为数字信号，供数据分析使用。

2.4 数据分析数据分析是流式细胞术的最后一步。

通过对获得的荧光信号的数字化处理，可以获得有关细胞的详细信息，包括细胞表面标记物的表达水平、细胞数量统计、细胞大小等信息。

数据分析可以使用专业的流式细胞仪软件完成，也可以使用其他数据分析软件进行更复杂的数据处理。

3. 应用流式细胞术作为一种全面、高通量的细胞分析技术，广泛应用于各个领域。

3.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中得到了广泛应用。

通过对免疫细胞的表面标记物进行检测，可以评估免疫细胞亚群的数量、功能和表达水平。

流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。

流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。

一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。

流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。

2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。

3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。

4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。

二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。

2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。

3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。

4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。

5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。

流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。

流式细胞术基本原理及应用流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学和临床医学研究的技术，能够快速、高效地分析和计数细胞，同时可以对细胞进行多参数的定位、鉴定和分离。

该技术的原理是通过激光束激发细胞中的荧光染料或标记物，然后检测细胞散射光的强度和荧光信号的强度，进而对细胞进行分析和排序。

本文将介绍流式细胞术的基本原理及其应用。

样本制备是流式细胞术的第一步，通过样本的处理来获取以细胞为基础的单细胞悬浮液。

这个过程可以通过机械或酶的方法破碎组织以获得细胞，并使用缓冲液来稀释细胞以避免细胞团。

通常，通过过滤或离心的方法，除去细胞碎片和大颗粒物质。

然后，用缓冲液沉淀细胞并冲洗细胞以去除细胞外的成分。

细胞悬浮是将细胞从红细胞和组织碎片中剥离并悬浮在缓冲液中的过程。

一种常用的方法是将细胞悬浮在含有胎牛血清等蛋白质的培养基中，以保持细胞的活力和稳定性。

细胞检测是流式细胞术的核心步骤，通过激光光束照射细胞，然后测量散射光和荧光信号来分析细胞的性状。

散射光包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。

FSC反映了细胞的大小和形态，SSC反映了细胞的复杂性和颗粒含量。

荧光信号是通过用具有荧光标记分子（如抗体或染料）标记细胞，然后用激光激发标记物并测量其荧光强度来检测的。

可以使用多个激光器和相应的滤光片来激发和检测多个荧光染料，从而实现多参数的分析。

数据分析是流式细胞术的最后一步，通过计算机软件对测量到的数据进行处理和解读。

数据分析可以根据散射光和荧光信号的特征，将细胞分类和鉴定。

可以根据亮度、大小和形状等参数来区分细胞的不同类型或亚群。

1.免疫细胞学研究：通过荧光标记的抗体，流式细胞术可以用来鉴定和分析细胞表面分子的表达情况和细胞亚群的分布。

例如，用荧光标记的CD4和CD8抗体可以区分T细胞亚群，并研究它们在疾病发展中的作用。

2.细胞周期分析：流式细胞术可以通过荧光染料标记DNA，从而实现对细胞周期的分析。

样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。

直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。

荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。

但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。

还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。

现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。

材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。

流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。

它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。

流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。

下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。

对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。

对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。

2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。

常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。

3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。

流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。

4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。

分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。

注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。

- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。

- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。

流式细胞术的原理流式细胞术是一种用于分析和分选细胞的技术，广泛应用于生物医学研究领域。

它能够快速、准确地分析细胞的表面标记物、内部结构和功能状态，为细胞生物学和免疫学研究提供了重要的手段。

流式细胞术的原理主要包括细胞样本的制备、激发光源的照射、细胞信号的检测和数据分析等步骤。

首先，对于流式细胞术的样本制备非常关键。

细胞样本需要经过胰酶消化、过筛等步骤，获得单细胞悬浮液。

然后，通过离心等手段将细胞沉淀，去除细胞培养基和其他杂质。

接着，将细胞悬浮液进行染色，使细胞表面或内部的标记物与荧光染料结合，以便后续的检测和分析。

其次，流式细胞术需要激发光源的照射。

常用的激发光源包括氩离子激光、氦氖激光等。

这些激发光源能够激发荧光染料发出荧光信号，不同的荧光染料对应不同的波长，因此可以通过选择不同波长的激发光源来激发不同的荧光信号，实现多参数的细胞分析。

然后，流式细胞术通过检测细胞信号来获取细胞的信息。

当细胞悬浮液经过流式细胞仪时，激发光源照射到细胞上，激发荧光染料产生荧光信号，流式细胞仪通过光学系统收集这些信号，并将其转化为电子信号。

这些电子信号经过放大、数字化等处理后，最终被传输到计算机中进行数据分析。

最后，数据分析是流式细胞术的重要步骤。

通过对细胞信号的数据分析，可以得到细胞的表面标记物表达情况、内部结构的特征、细胞的功能状态等信息。

同时，流式细胞术还可以进行细胞的分选，即根据细胞信号的特征，将特定类型的细胞进行分离和收集，为后续的实验研究提供纯净的细胞样本。

综上所述，流式细胞术通过样本制备、激发光源的照射、细胞信号的检测和数据分析等步骤，能够快速、准确地分析和分选细胞，为生物医学研究提供了重要的技术支持。

它在细胞生物学、免疫学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景，对于揭示细胞的生理和病理过程，以及开发新的药物和治疗手段具有重要意义。

流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记与细胞凋亡检测样品的制备。

知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。

实验步骤如下：(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。

(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或者藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性参照样品。

(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，通常在室温下反应15～30min 即可。

(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。

2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。

(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数通常为800～1000 r/min，5 min)。

(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或者PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。

(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。

注意：以上两种染色方法的抗体加入量与反应时间，没有非常具体的规定，通常应根据试剂使用说明书的要求进行。

若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。

制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可储存5d。

3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。

下面要紧介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或者EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm 专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性参照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳固与固定白细胞，静置5 min；④上流式细胞仪检测。

流式细胞术实验步骤流式细胞术（flow cytometry）是一项非常常用的细胞生物学研究技术，在许多领域都有着广泛的应用。

本文将为您介绍流式细胞术实验步骤，帮助您更好地掌握这一技术。

1. 细胞样品制备首先需要一个合适的细胞样品进行实验。

样品的选取要考虑细胞类型、细胞密度、细胞状态等因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。

对于非粘附生长的细胞，先用PBS洗涤一次，离心沉淀，将上清液倒掉，然后用PBS冲洗沉淀细胞一次，离心沉淀，去掉上清液，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS中消化脱落细胞。

之后用PBS洗涤脱落细胞，离心沉淀，去掉上清液，最后加入凝胶化培养基冻存备用。

2. 细胞计数在流式细胞术中，细胞计数非常重要。

可以使用hemocytometer或自动计数器进行计数。

计数完毕后，将细胞密度调整到准确的浓度，以免在后续实验中出现杂质和误差。

3. 细胞标记细胞标记可使用fluorescently-labeled antibodies或其他的探针，标记细胞表面分子或胞内分子。

标记的目的是识别和区分样品中的不同细胞类别。

处理方法：向细胞样品中加入适量标记抗体或荧光素等探针，使其与样品中的目标分子发生特异性结合。

4. 细胞过筛将经过标记的样品通过过滤网口，筛去大于0.22um的细胞碎片等杂质，以获得单个细胞进行后续实验。

5. 流式细胞术分析使用流式细胞仪进行分析，将样品喷入细胞术的流管中，在激光束之下，测量样品中标记细胞的荧光强度、散射度等参数。

通过比较样品与对照组，分析细胞类型、浓度和状态，建立起荧光相关表达式，以判定目标细胞类别。

6. 数据解析在流式细胞术分析的过程中采集了大量的数据，需要使用专业的软件进行数据解析、图形和表格生成。

数据解析的准确性和可靠性，对于实验结果和结论的推导有着至关重要的作用。

流式细胞术是一项详细的实验过程，需要严格遵守操作规范，才能获取可重复的实验结果。

本文简单介绍了流式细胞术实验步骤，希望能够提供实验操作指导，为广大科研工作者开展实验研究提供一定的帮助。

流式细胞仪技术要点学习流式细胞仪这么久，今天来说说关键要点。

首先呢，我理解流式细胞仪最基本的一个要点就是它的样本制备。

这个可得特别小心。

样本要是没弄好呀，后面那些高大上的检测啥的全白搭了。

就好比你要做饭，食材没洗干净或者没切对，那做出来的菜肯定不好吃。

在制备样本的时候，细胞得是分散的单个状态，不能有成团的现象。

我之前就老把这个搞砸，要么细胞太密集了，要么就有杂质，搞得检测出来的数据乱七八糟的。

我总结了个小技巧，在处理样本的时候啊，每一个步骤都要很轻柔很仔细，就像对待稀世珍宝一样。

另外，流式细胞仪的荧光标记这部分也超重要。

不同的荧光染料对应检测不同的细胞特性。

我记得我一开始总是搞混几种染料的用途，后来我就专门找了个小本子，把每一种常用的荧光染料对应的功能都抄下来，闲的时候就拿出来看看加强记忆。

这就像背单词似的，多重复才能记得住。

我理解这个荧光标记就像是给细胞穿上不同颜色的衣服，这样仪器就能识别不同类型的细胞了。

比如说你标记了绿色荧光的染料在某种细胞上，在仪器检测下，那种细胞就会显示出绿色的信号。

还有还有，参数的设置也是个难点啊。

好多个参数在那儿，什么散射光参数、荧光强度参数之类的。

我有时候看着那些参数就懵，不知道从哪儿下手。

后来我就慢慢一个个地去了解每个参数的意义，多试几次不同的设置，看看检测结果有啥变化。

就类似调整相机的参数来拍出不同效果的照片一样，这个参数设置错了，可能得出来的图像就很模糊或者根本看不出关键信息。

对了还有个要点，那就是仪器的校准。

我觉得这是很容易被忽视的一点。

校准没做好，准确性就无从谈起了。

这就跟秤没校准则称东西不准是一个道理。

要准确地使用标准微球等来校准仪器，这样检测的数据才有说服力。

我知道我对流式细胞仪的技术要点理解还不是非常全面，但这些都是我实打实学习过程中的一些经验分享。

我也是在不断学习摸索。

如果想要更深入精确的知识，可以去看一些专业的书籍，像《流式细胞术原理与应用》就很不错，还有很多相关的专业论文在知网上也能找到参考。

流式细胞术的样本制备方法流式细胞术的样本制备和染色方法是进行流式分析的基础，虽然是基础，但是样本制备可并没有那么容易，比如细胞数目的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠又会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，这是我们做流式的一大通病，特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。

今天，我们就看看如何从不同组织中分离出优质样本。

与贴壁或者悬浮细胞相比，组织样本的单细胞制备相对有一定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地方，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎片太多等。

下面就具体看看组织中的细胞如何制备。

目前，最常用两种方法是物理法和酶解消化法。

一、物理方法：原理：是指利用物理方法(机械法)分散组织，经过滤网过滤获得单细胞悬液。

应用：常用于处理部分软组织例如骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞。

优势：操作方便，耗时短，且能获得大量的细胞。

缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用;对硬组织或纤维组织效果不好。

操作步骤：1. 吹打：用移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的方法。

应用于：骨髓、腹腔、肺等组织中相对比较游离的细胞(骨髓、巨噬细胞等)。

2. 剪碎研磨法：用锋利的剪刀将组织剪碎后，并研磨以获得单个细胞的方法。

应用于：脾脏、淋巴结、胰腺等新鲜组织。

3. 网搓法：用100-300目的尼龙滤网固定于烧杯口，组织在网上轻搓，可用此法获得单个细胞的方法。

常应用于：正常的组织、瘤组织、淋巴结等标本。

二、酶解消化法：原理：利用酶(主要是胶原酶和蛋白酶)破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的方法。

应用：既可用于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。

4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaNO３终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaNO３0.2g (终浓度0.02％)流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

流式细胞术检测细胞样品
一、培养细胞
二、经0.25%胰酶消化后，PBS缓冲液洗涤，制成细胞悬液，70%乙醇固定。

（1.自己做的时候，细胞多也可以先离心，去掉乙醇。

2.收获细胞时，自己先用计数板数一下细胞，以上样的时候可以根据细胞多少增加或减少上样量）
三、室温下，经PBS（1~2ml）缓冲液洗涤1~2次（加入PBS后注意混匀），用PBS配平（天平）1500r/min，离心5min，去上清夜，留100μl沉淀。

0.2% Triton X-100 100μl处理细胞10min，PBS缓冲液洗涤及离心同上，去上清液，留100μl沉淀。

RNA酶水解5~10min，加5mg/L PI染色剂100μl染色标记细胞内的DNA，20min后，PBS洗涤离心去上清夜同上，留100μl沉淀。

用PBS缓冲液制成1*106的细胞悬液（用100μl沉淀+400μl PBS），待用。