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真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【摘要】旨在构建含有 MC1R基因的pcDNA3．1（＋）真核重组表达载体，为进一步研究 MC1R的生物学功能奠定基础。
应用RT‐PCR技术从羊驼皮肤cDNA 文库中扩增 MC1R基因全长cDNA ，然后通过双酶切将 MC1R基因全长cDNA 克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后，通过G418筛选培养，建立稳定的转染体系，直接荧光观察pcDNA3．1／MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位，并通过Western Blot方法检测 MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。
结果表明，成功构建了pcDNA3．1／MC1R重组表达载体，并且发现试验组的毛囊干细胞中表达 MC1R蛋白显著高于空白组（P＜0．05）。
成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3．1／MC1R ，且 MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。
%It is the base of further study on MC1R biological functions to construct the pcD‐NA3 .1 eukaryotic expression vector of MC1R gene in alpaca .MC1R gene was amplified by RT‐PCR with the cDNA from alpaca skin library .PCR products and pcDNA3 .1 plasmid were digested and recycled by BamHI and EcoRI endonuclease .The positive clones were selected , from which plasmid DNA was abstracted and identified by restriction endonuclease ,sequence identification and sequencing . ThepcDNA3 .1/MC1R recombinant expression plasmid was transfected into alpaca hair follicle stem cells by Lipofectamine TM 2000 .After screening culture by G418 ,a stably‐transfected cell system wasestablished .Fluorescent microscopy was em‐ployed to reveal the localization o f MC1R in alpaca hair follicle stem cells ,and the transcrip‐tion and expression of the MC1R were identified by Western Blot .The results show that eu‐karyotic expression vector pcDNA3 .1/MC1R was successfully constructed .When pcDNA3 . 1/MC1R recombinant expression plasmids were transfected into alpaca hair follicle stem cells , the expression ofMC1R was up‐regulated (P<0 .05) .This study successfully constructed eu‐karyotic expression vector containing green fluorescent protein gene pcDNA 3 .1/MC1R .It c ould up‐regulate the expression of MC1R in alpaca hair follicle stem cells .【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P86-90)【关键词】羊驼;黑素皮质激素受体1;毛囊干细胞;真核表达载体;转染【作者】白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【作者单位】山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801【正文语种】中文【中图分类】Q7822种天然毛色是羊驼的非常重要的经济性状之一［1］。
pCDNA 3.1／EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达目的为明确EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用，课题组体外构建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表达载体，并观察其在THP-1单核源性巨噬细胞中的表达情况。
方法重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后，借助Lipofectamine 2000将转染到THP-1单核源性巨噬细胞中，24h后倒置荧光显微镜下观察转染情况。
结果重组质粒经酶切鉴定、PCR和测序分析后，证实pCDNA 3.1/EC-SOD质粒构建成功。
将pCDNA 3.1/EC-SOD通过脂质体转入THP-1单核源性巨噬细胞后，倒置荧光显微镜下观察转染效率。
结论pCDNA 3.1/EC-SOD 载体构建成功，并成功在THP-1单核源性巨噬细胞中表达，为研究EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定了基础。
标签：EC-SOD；THP-1单核源性巨噬细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是体内重要的抗氧化防御系统，包括铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重视的细胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。
EC-SOD是Marklund等在1982年发现的一种分泌型糖蛋白，主要由巨噬细胞和血管平滑肌细胞产生，它是惟一分布在细胞外发挥抗氧化作用的酶，对机体的氧化/抗氧化平衡起至关重要的作用[2，3]。
EC-SOD可以清除脂质过氧化物、减轻氧自由基对组织细胞的过氧化损伤，并能降低脂质过氧化物形成，从而保护血管内皮免受氧自由基的损伤，防止动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的形成[4，5]。
为了更深层次的研究EC-SOD的作用机理，我们构建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表达载体，并成功转染了THP-1单核源性巨噬细胞，为进一步研究EC-SOD的作用奠定了基础。
・学术交流・pcDNA3-hN GFb真核表达载体的构建及其表达邓兴力 杨智勇 董坚 王廷华 徐丹 冯忠堂【摘要】 目的 构建人神经生长因子β(N GF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。
方法 以R T-PCR从人脑组织总RNA中扩增N GF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定N GF-β在细胞内的表达。
结果 R T-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hN GFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人N GF-βcDNA完全一致。
将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明N GF-β及其前体proN GF-β能在真核细胞中正确表达。
结论 成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,为后续的研究奠定基础。
【关键词】 神经生长因子; 真核表达; 重组质粒; 转染C onstru ction o f recombinant plasmid pcDN A32hNG Fb and its exp ression DEN G Xing2li,Yang Zhi2yong,DO N G J ian,et al. De partment of N eurosurgery,1st A f f iliated Hos pital of Kunming MedicalCollege,Kunming650032,China【Abstract】 Objective To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb and investigate its expression in L929cells.Methods The cDNA of human nerve growth factorbeta subunit(N GF-β)was amplified by R T-PCR from human brain tissue.By gene recombinationtechnique,human N GF-βcDNA was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.The recombi2nant plasmid was verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Transfected the recom2binant vector into L929cells with Lipofectamine2000transfection reagent.The expression of N GF-βwas analyzed by immunocytochemistery as well as western blot.R esults The R T-PCR product is750bp specific segment.By restriction enzyme digestion,the recombinant plasmid was digested into750bp and5.2kb f ragments.DNA sequence result showed the750bp f ragment was identical with humanN GF-βcDNA in GenBank.Immunocytochemistery and western blot showed the N GF-βwas expressedsuccessfully in L929cells.Conclusions The recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb was constructedsuccessfully,which will provide the foundation for f urther research.【K ey w ords】 Nerve growth factor(N GF);Eukaryotic expression;Recombinant plasmid;T ransfection中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)022******* 神经生长因子(nerve growt h factor,N GF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。
真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响目的：构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达，并观察其对HEC 细胞增殖的影响。
方法：通过RT-PCR和T/A克隆等方法，构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中，通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC 中表达的情况，并设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白脂质体对照组，用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况，MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等，研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。
结果：经限制性内切酶鉴定及测序，证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确，将其转染HEC细胞，转染后的HEC细胞在体外能继续增殖，但增殖能力明显下降。
结论：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功，并能在HEC细胞中表达，转染HEC细胞体外增殖能力明显降低，Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。
Beclin1；真核表达载体；细胞；增殖子宫内膜癌（EC）是仅次于乳腺癌和宫颈癌的常见女性生殖系统恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。
其发病率每年10万人约有24.6人，在我国近二十年来也呈逐年上升趋势，但其发生、发展机理仍不十分明确。
多数学者认为其发生发展与雌激素水平密切相关[2]。
长期无拮抗的雌激素刺激可能是主要发病因素，在实验动物中可观察到雌激素引起子宫内膜有丝分裂增多的现象。
全人源scFv-Fc真核表达载体的构建与鉴定叶迎春;年四季;刘佳佳;王栩;高燕;袁青【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2014(030)002【摘要】目的:构建全人源抗IL-33 scFv-Fc重组载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO),表达并鉴定融合抗体蛋白.方法:RT-PCR扩增人IgG1 Fc段并捅入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1/Fc重组载体;将合成的信号肽(SP)序列插入重组质粒pcDNA3.1/Fc,构建重组pcDNA3.1/SP-Fc通用载体;最后将本实验室前期筛选的抗IL-33 scFv插入重组质粒pcDNA3.1/SP-Fc中,构建重组pcDNA3.1/SP-scFv-Fc载体,测序正确后转染CHO细胞.RT-PCR 、Westem blot检测目的基因的转录及表达.结果:重组质粒测序结果表明成功地构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc重组真核表达载体,插入的SP-scFv-Fc目的基因大小为1 560 bp左右.转染CHO细胞后,RT-PCR结果显示目的基因在CHO细胞中成功转录,Western blot显示表达的蛋白可以和羊抗人IgG1 Fc抗血清发生特异性免疫反应.结论:成功构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc重组真核表达载体,以便于后续在CHO细胞中表达.【总页数】4页(P226-229)【作者】叶迎春;年四季;刘佳佳;王栩;高燕;袁青【作者单位】泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.人源性14-3-3σ真核表达载体的构建及鉴定 [J], 甘露;朱阅伟;周美娟;欧程山;丁振华2.牛源性无乳链球菌分离鉴定及 cfb 基因的克隆和真核表达载体的构建 [J], 阚威;王华;马友记;赵兴绪;张勇3.人源性Notch1跨膜段真核表达载体的构建及鉴定 [J], 张凯举;余和芬;张玉祥4.人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定 [J], 栗炳南;李卫东;林俊堂;丰慧根5.人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定 [J], 栗炳南;李卫东;林俊堂;丰慧根;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pcDNA3-hNGF真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达粟谋;贝朝涌;蒋林彬;徐威;陈宁【摘要】目的构建人神经生长因子(hNGF)真核表达载体pcDNA3-hNGF,检测其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达.方法利用PCR扩增hNGF全长cDNA,构建真核表达载体pcDNA3-hNGF,经测序证实后将其转染至大鼠骨髓基质干细胞中,利用Western blot方法检测hNGF的表达情况.结果 DNA测序结果显示构建的pcDNA3-hNGF表达载体与实验设计相符.Western blot检测显示该重组载体转染大鼠BMSCs 72h后,有hNGF的过表达.结论构建的pcDNA3-hNGF能在骨髓基质干细胞过表达hNGF蛋白,本研究为应用神经生长因子修饰的骨髓基质干细胞进行骨折治疗奠定了基础.【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2016(022)001【总页数】4页(P41-44)【关键词】神经生长因子真核表达载体;骨髓基质干细胞;表达【作者】粟谋;贝朝涌;蒋林彬;徐威;陈宁【作者单位】桂林医学院附属医院四肢创伤骨科 541001;桂林医学院附属医院四肢创伤骨科 541001;桂林医学院生物技术学院 541004;桂林医学院附属医院四肢创伤骨科 541001;桂林医学院附属医院四肢创伤骨科 541001【正文语种】中文【中图分类】R68神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)在促进骨折愈合修复中是重要生长因子之一[1]。
骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)是目前已成为应用较广泛的骨组织工程重要种子细胞[2，3]。
基因组织工程给我们提供了良好的方法，它利用基因转染技术使得编码特定功能因子的基因转至种子细胞里或生物活性基质材料，让转染细胞表达目的基因及产物，在体内促进细胞的增殖、分化而发挥正常的生理功能。
本研究实验利用PCR方法扩增hNGF基因cDNA，构建重组质粒pcDNA3-hNGF并转染至大鼠BMSCs中，检测其表达活性。
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
1pc DNA3.12Ercc6l真核表达载体的构建及在P19细胞内的表达张 庆1,陈祥贵2(1.泰山医学院生物科学系,山东泰安 271016;2.西华大学生物工程学院,四川成都 6180039)摘要:目的 构建Ercc6l的正、反义真核表达载体,并在P19胚胎癌细胞内瞬时表达,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。
方法 KpnⅠ/XhoⅠ双酶切p G E M2T2Ercc6l获得目的基因Ercc6l,将其克隆到同样经过双酶切的真核表达载体pc DNA3.1(+)和pcD NA3.1(2)M yc H is6,重组质粒pcDNA3.1(+/2)2Ercc6l经菌落PCR和双酶切鉴定;脂质体介导法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,R T2PCR检测基因在细胞内的表达活性情况。
结果 重组质粒经菌落PCR和K pnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,表明真核表达载体构建正确;脂质体介导法瞬时转染正义载体至P19细胞后,检测表明转染细胞能够表达Ercc6l。
结论 成功构建了Ercc6l正、反义真核表达载体,其正义载体转染真核细胞后能在其中表达。
关键词:Ercc6l;真核表达;P19胚胎癌细胞;RT2PCR中图分类号:Q782 文献标识码:A 文章编号:100427115(2008)0320164205C on struct ion of eukar yot ic expr ession vector s pcD NA3.12Ercc6lan d its expr essi on i n P19cellsZHA N G Q ing1,CHEN X i a ng2gui2(1.Dep t.of B i ol ogical Science,Taishan M edical Col l ege,Taian 271016,Ch i na;2.Dep t.of B i otechnol ogy,Xi hua Un i versity,Chengdu 610039,China)Ab stra ct:Objec tive:T o construct s ense and antisens e eukary otic ex p re ssion vec t ors of novel gene Ercc6l and study its transfec ti on and transient ex pressi on in P19cells.M ethods:T he ORF of Ercc6l was obtained by dige stion with Xh oⅠand K pnⅠrestricti on endonuc l ea se in the plas m id of pGE M2T2Ercc6l.R eco m binant vectors we re construc t ed by inserting the targe t code gene i nto the MCS of pla s m id pcDNA3.1(+)and pc DNA3.1(2)M yc H is6bet ween XhoⅠand K pnⅠsit e s. Then the reco mbinant pla s m ids we re identified by colony PCR and restricti on enzy m e analysis.So we could ch oose app r o2 p riate recombinant p las m id whi ch had been identified by restricti on enzy me analysis t o transfect P19cells u sing li pofectin mediati on.R T2PCR wa s p erfor m ed t o i dentify the expressi on levels of Ercc6l mRNA afte r transfec ti on.Re sults:As s c reened by col ony PCR and identified by restricti on enzy m e dige stion,the sens e and antisense ex pressin vectorswere suc2 cessfully constructed by subcloning the OR F of Ercc6l t o pcDNA3.1.The ex p ression acti vity of Ercc6l wa s de tected afte r transfec ti on in mous e em bry ona l ca rcino m a cells.Conclusion:The sense and antisense euka ry otic ex pressi on vect o rs of n o2 vel gene Ercc6l are succe ssfully constructed.Key wor d s:Ercc6l;Eukaryotic ex p re ssion;P19embryonal carcino m a cells;RT2PCR Er cc6l[1](excisi on r epair cr oss2comple m enting r o2 dent repair defic iency,comple m entation gr oup62like)是在寻找胚胎发育相关基因的研究中,采用EST介导的基因克隆策略,从小鼠胚胎成功克隆的新基因(G enBank接受号:AY172688),长4002bp,编码1240个氨基酸,属于S NF2家族ERCC6亚家族。
随后对基因Ercc6l的研究表明,在包括脑、心脏的大多数组织中,该基因在胚胎期高表达,出生后表达迅速下调,而成年正常组织除脾和肺外检测不到表达信号[1]。
乙醇处理孕鼠或体外培养的全胚胎均导致胚胎畸形的发生并伴随Er cc6l的表达下降[2]。
这些结果提示该基因在胚胎发育过程中可能具有重3作者简介张庆(—),男,山东新泰人,硕士,助教,主要研究方向生物医学。
:1979:要作用。
虽然Ercc6l在大多数成年组织中不表达,但是在多种肿瘤组织和细胞系中高表达,显示其与肿瘤有密切关系。
利用公共数据库资源进行的数字化表达分析表明其侯选的人同源基因也具有非常相似的表达特征。
从这些方面看,该基因在胚胎和肿瘤细胞增殖和分化调控等方面的功能值得深入研究。
本试验研究目的就是在既往研究的基础上构建E r cc6l的正、反义真核表达载体,并采用脂质体瞬时转染正义载体至P19细胞,检测基因在细胞内的表达活性情况。
为在细胞水平及今后深入探讨基因E r cc6l的各项功能研究奠定了基础,以及对其进行靶向基因治疗提供了依据。
1材料和方法1.1 材料1.1.1 质粒、菌株、细胞含有目的基因的克隆载体pGE M2T2Ercc6l、表达载体pEGFP2Ercc6l、真核表达载体pc DN A 3.1 (+),本试验室保存;真核表达载体pcD NA3.1(2) Myc H is6Ve r C,奥地利I nnsbruck医科大学I lja V ietor博士惠赠;E.coli.DH5α菌株,本实验室保存。
P19胚胎癌细胞株,购自上海中科院细胞库。
1.1.2 主要试剂限制性内切酶XhoⅠ、K pnⅠ均为美国Pr om ega 公司产品;L ipofecta m ine2000转染试剂、TR I ZOL Re2 agent均为美国I nvitr ogen公司产品;UN I Q210柱式DNA胶回收试剂盒,Sangon公司产品;RNase inhibi2 tor、A MV反转录酶、DNA Ligation Kit2Ligation H igh 均为为T OY OBO公司产品;Long Taq DNA Poly m er2 a se、dNTP s、DNA Marke r均为北京天为时代科技有限公司产品;所有引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
1.2 方法1.2.1 Ercc6l基因正义、反义真核表达载体的构建用K pnⅠ和XhoⅠ分别分步双酶切pGE M2T2Er2 cc6l质粒及真核表达载体pc DNA3.1(+)和pc D2 NA3.1(2)Myc H is6,琼脂糖凝胶电泳,胶回收纯化后,分别获得目的基因Ercc6l(约3.7kp)和开链真核表达载体pc DN A3.1(+)、pc DNA3.1(2)M yc H is6(约5.4kp)。
核酸蛋白仪测其浓度,然后用以目的基因和空载体3∶1的摩尔比混合,在DNA L K2L的作用下6℃,3,连接产物转化感受态D5α,在含LB 平板上过夜培养,筛选转化菌落。
1.2.2 重组真核表达载体的鉴定菌落PCR鉴定:在Amp icilin/LB平板上随机挑取饱满、透亮、大小合适单个菌落接种于含100μg/ m l A m p的LB培养液中,37℃静止培养10h左右,菌落PCR鉴定。
设计特异性引物:通过网址ht2 t p://ww w.ncbi.nl 进入Genebank数据库,查找Er cc6l的mRNA序列,应用P ri me r Pre m i2 er5.0引物设计软件进行引物设计,然后应用O ilgo 6.65软件对引物进行评价分析。
并在引物上、下游分别加入XhoⅠ和K pnⅠ的酶切序列(粗体所示)及相应内切酶所需的保护碱基。
上游引物序列:5’2CT2 GT CTC G AG G CC ATG G AG G C T TCC CAA G23’,下游引物序列:5’2CG C GG T ACC TTC TG A AAT GTT CAG CTG C23’,预期扩增产物长度为3749bp。
P CR 循环程序为:94℃预变性2m in后扩增,即94℃40 s、56℃1m in、72℃4m in,30次循环后再72℃延伸5m in。
同时以G3P DH为内参照,上游引物序列: 5’2TG A AGG TCG GTG TG A ACG G AT TTG G C23’,下游引物序列:5’2CAT GT A GG C C AT G AG G TC CAC CAC23’,预期产物长度961bp。
PCR循环程序为:94℃预变性3m in后扩增,即94℃30s、68℃30 s、68℃60s,共25次循环,然后68℃延伸5m in。
扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分析。
