细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆,测序及特性分析3

格式：pdf
大小：125.76 KB
文档页数：4

下载文档原格式

细粒棘球蚴热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

细粒棘球蚴热休克蛋白70基因的克隆和序列分析丁淑琴;赵嘉庆;王娅娜;王健;赵巍【期刊名称】《宁夏医学杂志》【年(卷),期】2005(27)8【摘要】目的获得细粒棘球蚴(E.granulosus)热休克蛋白(Heat ShockProtein70,HSP70)基因,进行DNA测序、序列特性分析及同源性分析,为研究包虫病重组疫苗候选基因奠定基础.方法从细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株HSP70基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析.结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株HSP70基因,测序表明该片段由402bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为96%,推导编码氨基酸序列同源性为81%.结论经DNA测序证实,扩增出的片段确为HSP70,该片段阅读框完整,可作为重组抗原的候选基因.【总页数】3页(P507-509)【作者】丁淑琴;赵嘉庆;王娅娜;王健;赵巍【作者单位】宁夏医学院,宁夏,银川,750004;宁夏医学院,宁夏,银川,750004;宁夏医学院,宁夏,银川,750004;宁夏医学院,宁夏,银川,750004;宁夏医学院,宁夏,银川,750004【正文语种】中文【中图分类】R532.32【相关文献】1.西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布 [J], 田照辉;徐绍刚;王巍;胡红霞;董颖;宋超2.西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70 cDNA的克隆、序列分析和组织分布 [J], 田照辉;徐绍刚;王巍;胡红霞;董颖;宋超3.三株弧菌热休克蛋白70基因的克隆和序列分析 [J], 黄东东;何鸣筱;吕玲;翁少萍;常迪;邓先余;何建国4.飞蝗热休克蛋白70cDNA片段的克隆和序列分析 [J], 王宪辉;陈兵;康乐5.柞蚕热休克蛋白70基因的克隆和序列分析 [J], 孙茜;刘朝良;朱保健;刘秋宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究蔡辉霞;沈玉娟;韩秀敏;袁忠英;王虎;徐馀信;胡媛;卢潍媛;官亚宜;曹建平【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》【年(卷),期】2011(29)3【摘要】目的克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值。

方法从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析。

以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果。

结果双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功。

SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,产物以可溶蛋白形式存在,重组蛋白EgEPC1的相对分子质量(Mr)约为11 000,可被细粒棘球蚴病患者混合血清识别。

EgEPC1对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性和特异性分别为78.3%(47/60)和98.3%(59/60),与多房棘球蚴病患者血清交叉反应阳性率为40.5%(15/37)。

结论 EgEPC1重组抗原对细粒棘球蚴病具有较好的诊断价值。

【总页数】5页(P167-171)【关键词】细粒棘球绦虫;EPC1基因;基因表达;免疫诊断【作者】蔡辉霞;沈玉娟;韩秀敏;袁忠英;王虎;徐馀信;胡媛;卢潍媛;官亚宜;曹建平【作者单位】中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心,上海200025;青海省地方病预防控制所,西宁811602【正文语种】中文【中图分类】R383.33【相关文献】1.细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建 [J], 丁剑冰;林仁勇;温浩;王国荃;王笑峰;魏晓丽;傅玉才2.新疆细粒棘球蚴免疫诊断抗原B亚单位3基因的克隆及序列分析 [J], 马海梅;陈洁;古力帕丽·麦曼提依明;陈璐;丁剑冰;吾拉木·马木提3.细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建 [J], 丁剑冰;林仁勇;温浩;许晏;魏晓丽;王国荃4.细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达 [J], 韩秀敏;贾万忠;史大中5.细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化 [J], 江莉;冯正;许学年;薛海筹;冯宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球蚴TSP1和TSP6基因的克隆及生物信息学分析

ＨＵＺｈｅｎｇ — ｘｉａｎｇ，ＣＡＩＸｕｅ－ｐｅｎｇ，ＣＨＥＮＣｈｕａｎｇ — ｆｕ
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３，Ｃｈｉｎａ；
华北农学报・２０１５。３０（２）：４１－４６
细粒棘球蚴ＴＳＰ１和ＴＳＰ６基因的克隆及生物信息学分析
刘田莉，孟庆玲，乔军，陈诚，马玉，胡政香，才学鹏，陈创夫
ｒａｓｐａｎｉｎ１－ＴＳＰ６（Ｐ６），ｐｒｉｍｅｒｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＥｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｒａｎｕｌｏｓｕｓｇｅｎｏｍｅｄａｔａｂａｓｅｉｎＧｅｎＢａｎｋｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ
ａｎｄｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰａｎｄＴＳＰ６ｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲｒｆｏｍｈｙｄａｔｉｄｐｒｏｔｏｓｃｏｌｅｘ．
００７１５）同源性为９８．１８％，其推导的氨基酸序列同源性为８５．０７％。运用分子生物学软件对ＥｇＰＪ和ＴＳＰ６基因进

细粒棘球蚴重组抗原B的制备、纯化及鉴定

细粒棘球蚴重组抗原B的制备、纯化及鉴定陈新华;温浩;卢晓梅;张金辉;林仁勇;郑树森【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》【年(卷),期】2005(23)5【摘要】目的制备细粒棘球蚴人工重组抗原B。

方法构建pMalc2x-AgB质粒,在原核系统大肠埃希菌JM109中诱导表达,将所得融合蛋白rAgB-MBP用蛋白水解酶Xa(FactorXaProtease)进行消化,酶切产物用两步亲和层析进行分离纯化。

经过直链淀粉树脂柱、羟基磷灰石柱,获得了纯化的细粒棘球蚴人工重组抗原B,并用Westernblotting对抗原B的特异性进行了鉴定。

结果制备的抗原B(rAgB)相对分子量(Mr)为12000,rAgB经过原核表达、酶切、层析柱分离后依然保持抗原活性。

结论用分子生物学手段制备并纯化了人工重组抗原B,为批量生产诊断抗原、制备单克隆抗体及筛选噬菌体抗体库奠定了基础。

【总页数】4页(P296-299)【关键词】棘球蚴病;重组抗原B;亲和层析【作者】陈新华;温浩;卢晓梅;张金辉;林仁勇;郑树森【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科;新疆包虫病临床研究所,新疆包虫病基础医学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R383.33【相关文献】1.细粒棘球蚴谷胱甘肽s-转移酶重组抗原的高效融合表达、纯化及免疫特性的研究[J], 李宗吉;黄瑾;张静;张焱;王洁;王淑静;高岭;赵巍2.细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组、表达、纯化及免疫学特性鉴定 [J], 丁聃;王娅娜;王洁;王淑静;张焱;李宗吉;赵巍3.细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定 [J], 马锐;师志云;于晶晶;王淑静;王洁;张焱;高岭;赵巍4.细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定 [J], 于晶晶;于辛酉;王娅娜;师志云;马锐;卜阳;罗永云;赵巍5.细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定 [J], 卜阳;李昭宇;师志云;马锐;于晶晶;于辛酉;赵巍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球绦虫miRNAs的鉴定及分析

细粒棘球绦虫miRNAs的鉴定及分析
郝力力;李锐;李必富
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】2012(024)004
【摘要】细粒棘球绦虫具有复杂的基因调控模式,在中间宿主和终末宿主体内具有截然不同的生物学特性.miRNA是真核生物内存在的非常重要的调控因子,本研究采用Solexa高通量测序技术,对G1株原头蚴microRNAs进行了鉴定和分析,总共发现了108条miRNAs,其中26条属于保守家族,82条是细粒棘球绦虫特有.【总页数】4页(P654-657)
【作者】郝力力;李锐;李必富
【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所,浙江杭州310021;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041
【正文语种】中文
【中图分类】S852.7
【相关文献】
1.鳜不同孵化时期miRNA转录组分析及生长相关miRNA鉴定 [J], 赵岩;曹晓颖;周昊天;宋凌元;涂翰卿;黄思颖;赵金良
2.水牛泌乳期与非泌乳期乳腺组织miRNAs表达谱鉴定及差异表达分析 [J], 蔡小艳;鲍正攀;古景开;邓凯;张晓溪;任艳萍;沈朋雷;石德顺;刘庆友
3.水牛泌乳期与非泌乳期乳腺组织差异miRNAs的表达模式鉴定及分析 [J], 蔡小
艳;王鹏程;邓凯;王萍;冯万有;张晓溪;任艳萍;刘庆友;石德顺
4.牦牛Linc24063的克隆鉴定及其与miRNAs表达水平的相关性分析 [J], 王会; 柴志欣; 朱江江; 钟金城; 张成福; 信金伟
5.乌头驴与三粉驴骨骼肌中miRNAs的表达鉴定与分析 [J], 马程;胡文萍;石田培;侯浩宾;李海静;张新浩;杨莉;张莉
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球蚴抗原B酵母表达载体的克隆与序列分析(英文)

细粒棘球蚴抗原B酵母表达载体的克隆与序列分析(英文)卢晓梅;张利华;张文宝;林仁勇;Philip Craig;McManus Don;温浩【期刊名称】《中国寄生虫病防治杂志》【年(卷),期】2003(16)3【摘要】目的获得重组细粒棘球蚴抗原 B(Eg B)的真核表达蛋白 ,构建 Eg B酵母表达重组体 ,并对构建的重组体进行序列分析。

方法以原核重组体 JM10 9- p Mal2 x Eg B作为模板 ,采用聚合酶链式反应 (PCR)扩增 Eg B片断。

目的基因 Eg B片断插入酵母表达载体 p YES2 / NT B,再将酵母表达重组体转化 DH5 a菌 ,并对转化筛选的重组体进行序列分析。

结果共筛选得到 16个重组克隆 ,其中 7个克隆证实为 Eg B正确序列 ,并与酵母表达载体的开放阅读框 (ORF)相一致。

结论成功地将细粒棘球蚴抗原 B基因构建入酵母表达载体 p YES2 / NT B的开放阅读框。

此重组体可在酵母中进一步表达特异性蛋白。

【总页数】3页(P159-161)【关键词】细粒棘球蚴;抗原B;酵母表达载体;克隆;序列;聚合酶链式反应【作者】卢晓梅;张利华;张文宝;林仁勇;Philip Craig;McManus Don;温浩【作者单位】新疆医科大学第一附属医院包虫病临床研究所;澳大利亚昆士兰医学研究中心;英国桑福德大学生物科学系【正文语种】中文【中图分类】R383.33【相关文献】1.细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析 [J], 师志云;王娅娜;马锐;于晶晶;于辛酉;高岭;赵巍2.新疆细粒棘球蚴免疫诊断抗原B亚单位3基因的克隆及序列分析 [J], 马海梅;陈洁;古力帕丽·麦曼提依明;陈璐;丁剑冰;吾拉木·马木提3.分泌抗细粒棘球蚴原头蚴抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 [J], 刘卫;刘金凤4.抗细粒棘球蚴原头蚴单克隆抗体对几种抗原的识别作用观察 [J], 陈德华;陈燕军5.细粒棘球蚴egG1Y162抗原基因的克隆及蛋白质序列分析 [J], 曹春宝;马秀敏;丁剑冰;贾海英;吾拉木·马木提;张海涛;朱明;马海梅;吕国栋;温浩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球蚴SmadA基因的克隆及其功能的初步鉴定

细粒棘球蚴SmadA基因的克隆及其功能的初步鉴定李静;张传山;吕国栋;王俊华;魏绪法;林仁勇;剡根强【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2011(42)12【摘要】The objectives of this study were to clone the EgSmadA gene of Smad family from Echinococcus granulosus, identify its structure and expression profile of the protein, and construct its yeast two-hybrid system. The EgSmadA gene was cloned and analyzed by bioinformat-ics, and detected its expression profile by immunohistochemisty. The results showed that EgSmadA genomic DNA is 4 069 bp, contains 4 exons, 3 introns and a complete open reading frame of 957 bp in length, which encodes for a peptide of 318 amino acids. A conserved MH2 (Mad ho-mology) domain of Smad family was detected in the C-terminal of EgSmadA, and the yeast two-hybrid system of EgSmadA and EgSmadA-MH2 were successfully constructed. Immunolocaliza-tion results indicated that EgSmadA was expressed in the tegument of protoscolex and cellular germinal layer of metacestode. The results provided some new clues for further studying the biological functions of EgSmadA in the growth and development of Echinococcus.%本研究旨在克隆细粒棘球蚴Smad蛋白家族基因EgSmadA,鉴定其结构及表达部位,并建立酵母双杂交体系.利用生物信息学方法,克隆及分析EgSmadA基因的DNA全长序列,采用免疫组化技术鉴定EgSmadA蛋白的表达及分布,并构建该基因酵母双杂交载体.结果表明,成功扩增出EgSmadA基因组序列全长4 069 bp,包含4个外显子和3个内含子,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸,该蛋白C端含有Smad蛋白家族进化高度保守的典型结构域MH2 (Mad homology),并成功构建该基因及其MH2结构域的酵母双杂交载体.免疫组化定位该蛋白主要表达于原头蚴被膜及囊泡生发层.研究结果为进一步研究EgSmadA在细粒棘球蚴生长发育中的作用奠定了基础.【总页数】7页(P1756-1762)【作者】李静;张传山;吕国栋;王俊华;魏绪法;林仁勇;剡根强【作者单位】石河子大学动物科技学院,石河子832003;新疆医科大学第一附属医院医学研究中心/新疆包虫病基础医学重点实验室,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院医学研究中心/新疆包虫病基础医学重点实验室,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院医学研究中心/新疆包虫病基础医学重点实验室,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院医学研究中心/新疆包虫病基础医学重点实验室,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院医学研究中心/新疆包虫病基础医学重点实验室,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院医学研究中心/新疆包虫病基础医学重点实验室,乌鲁木齐830054;石河子大学动物科技学院,石河子832003【正文语种】中文【中图分类】S852.734【相关文献】1.HLA-B2704重链胞外功能区基因片段的克隆表达及其生物学功能的初步鉴定[J], 于坤;袁方;代东发;梁飞;刘楠;赵晓;郝玉娜;奚永志;孙玉英2.白木香愈创木烯合酶基因(AsSGS)启动子的克隆及功能初步鉴定 [J], 何访;梅文莉;李辉亮;郭冬;彭世清;戴好富3.大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆及功能初步鉴定 [J], 王俊; 董海冉; 常宏; 王伟; 包冬芳; 赵孝岳; 赵雪; 韩英鹏4.大豆胞囊线虫病4号生理小种抗性候选基因GmRSCN4-3克隆与功能初步鉴定[J], 韩英鹏;孙秋霞;包冬芳;董海冉;张婵娟;赵雪;李文滨5.水稻OsRPK2基因的克隆及功能初步鉴定 [J], 张福臻;刘方惠;陈鑫欣;孙静;葛荣朝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建丁剑冰;林仁勇;温浩;王国荃;王笑峰;魏晓丽;傅玉才【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2003(019)001【摘要】目的克隆Eg95抗原基因,构建携带目的基因的真核表达载体,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料.方法应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列.结果测序表明所选pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒,可以作为DNA疫苗作进一步的研究.结论成功构建真核细胞表达载体pcDNA3-Eg95.【总页数】3页(P42-44)【作者】丁剑冰;林仁勇;温浩;王国荃;王笑峰;魏晓丽;傅玉才【作者单位】新疆医科大学免疫学教研室,乌鲁木齐,830054;新疆维吾尔自治区包虫病临床研究所;新疆维吾尔自治区包虫病临床研究所;新疆医科大学环境卫生教研室;新疆维吾尔自治区包虫病临床研究所;新疆医科大学免疫学教研室,乌鲁木齐,830054;汕头大学医学院病原生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R383.3+3【相关文献】1.细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建 [J], 丁剑冰;林仁勇;温浩;许晏;魏晓丽;王国荃2.全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建 [J], 林仁勇;丁剑冰;温浩;王笑峰;魏晓丽3.细粒棘球蚴eg95基因的克隆以及原核融合表达 [J], 贾如;邹媛媛;李轶女;魏兆军;沈桂芳4.青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析 [J], 韩秀敏;史大中;贾万忠;杨永海;王虎5.细粒棘球蚴内蒙株疫苗候选基因EG95克隆 [J], 李志伟;王志钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球绦虫Eg7-1基因克隆与表达

细粒棘球绦虫Eg7-1基因克隆与表达沈继龙;Ronald E Blanton【期刊名称】《热带病与寄生虫学》【年(卷),期】1999(028)001【摘要】自细粒棘球λg11cDNA文库中筛选出一诊断抗原基因Eg7-1.PCR扩增基因片断,直接插入携带3'-T的载体pCR21内.在INVαF'内扩增目的基因.经Bam HI和HinsⅢ酶切后,将目的基因亚克隆到表达质粒PRSET b内,转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE和免疫印迹检测到表达产物(40kDa).该重组抗原与曼氏血吸虫病人血清及正常人血清无交叉反应.【总页数】2页(P7-8)【作者】沈继龙;Ronald E Blanton【作者单位】蚌埠医学院,蚌埠,233003;Division of GeographicMedicine.CWRU.U.S.A.【正文语种】中文【相关文献】1.三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)叉头蛋白2(foxl2)基因和性别决定框14(sox14)基因克隆与表达分析 [J], 叶容晖;任海波2.细粒棘球绦虫EgM123基因序列分析及EgM家族基因在虫体不同发育阶段的差异表达分析 [J], 毛丽萍;王正荣;王伟;魏玉圆;翟少华;甘尚权;简子健3.小拟南芥转运蛋白基因及NHX2基因的克隆与表达 [J], Sun Qi;Huang Wei;Liu Fang;Jin Yuhuan;Xiao Jianwang;Huang Xianzhong4.细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株基因组全长cDNA的构建[J], 翟少华;阿尔祖古丽·阿卜力孜;王楠;胡美荷;赵魁;贺文琦5.栀子UGT基因家族UGT86A1和UGT85A2基因克隆与表达模式分析 [J], 刘倩;谷振军;符潮;杨春霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细粒棘球蚴线粒体ND1基因的克隆与序列研究

第４５卷第５期２０１６年９月
内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）
摘
要：为了研究细粒棘球蚴（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｒａｎｕｌａｓｕｓ）种间遗传标记特点，在内蒙古地区采集羊肝脏中的
细粒棘球蚴，或通过手术将患者的包虫剥离囊包后采集细粒棘球蚴，提取虫体ＤＮＡ，扩增线粒体细胞色素氧化酶１（ＮＤ１）基因，将其克隆到ＰＧＭ— Ｔ载体后，用ＰＣＲ技术鉴定阳性菌落，并进行测序．研究结果表明，细粒棘球蚴ＤＮＡ扩增出的羊株、人株ＮＤ１基因序列片段长度为８９５ｂｐ，ＮＤ１基因序列稳定保守，无宿主特异性，可作为细粒
型存在１０种，且具有基因的多态性．这种基因多态性反映了各种不同基因型的细粒棘球绦虫在进化速度、生
活史、宿主选择性、致病性、抗原性和药敏性等方面的一些特性．因此，在控制包虫病流行的措施巾，最基本的
也是最重要的措施是确定本地区细粒棘球蚴的基因型］．
１材料与方法

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

文章编号:1001-5949(2005)08-0510-03・论　著・细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆、测序及特性分析3王　健,赵嘉庆,王娅娜,丁淑琴,赵　巍 [摘要]　目的　对细粒棘球蚴(E.granulosus)翻译延伸因子(translation elongation factor)EF-1基因片段进行分子克隆及序列分析。

方法　从细粒棘球蚴原头蚴中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴EF-1基因片段,与p GE M-T载体重组并转化E.C oli JM109,经筛选扩增获得重组基因克隆,再进行序列测定和分析。

结果　成功构建了EF-1/p GE M-T/JM109克隆体系,测序表明该基因开放阅读框为693bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为99%。

结论　扩增获得的基因片段可能为细粒棘球蚴(E.granu2losus)翻译延伸因子EF-1基因片段。

[关键词]　棘球蚴病;基因,结构;克隆,分子;序列分析[中图分类号]　R532.32 [文献标识码]　ACloning and sequence analyzing of the EF-1gene from echinococcus granulosus of m ankind WANG Jian,ZH AO Jia-qing,WANG Ya-na,et al.(Ningxia Med.C oll.,Y inchuan750004,China)Abstract　Objective　T o obtain and analyze sequence EF-1gene,and lay bases for screening candidate antigen of echinococcus granulosus.Methods　T otal RNA was extracted from protoscoles of cysts from humam.The specific primers were designed according to published nucletid sequence in the genbank database.The EF-1gene of echinococcus granulosus was amplified by RT-PCR and cloned into p GE M-T vector for sequencing and analyzing.R esults　A cDNA sequence with an open reading frame of693bp has been amplified success fully by RT-PCR.C omparision of the DNA and amino acid sequence deduced from cDNA with the published EF-1gene sequence of echinococcus granulo2 sus in the genbank revealed99%identity samely.Conclusion　Because the EF-1play an importante role in energy metabolism of E.granulo2 sus,EF-1gene gained from protoscoles can be used as candidate antigene gene to develope vaccine and its biological functions studying.K ey w ords　Echinococcosis;G enes structural;Cloning molecular;Sequencing 细粒棘球蚴病又称包虫病,是世界上许多国家影响人类健康和经济发展的重要人兽共患病之一。

在我国25个省(市、自治区)有包虫病的流行,西北五省区为主要流行区,人群患病率在0.6%- 4.5%之间1。

目前包虫病治疗主要以药物和手术治疗方法为主,由于药物和手术治疗存在复发率高等缺点,使得包虫病难以得到有效的根治2。

随着分子生物学技术的发展,国内外积极开展对寄生虫疫苗的研究,并已取得了可喜的进展3。

本研究旨在获得E.gran2 ulosus EF-1基因片段对其基因的结构特点及同源性进行分析,为进一步开展的重组抗原研制工作打下基础。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　细粒棘球蚴原头蚴的收集:从宁夏医学院附属医院包虫病患者手术摘除的完整包囊,无菌条件　3国家自然科学基金项目(项目编号:30260105)　[作者单位]宁夏医学院,宁夏银川750004　[作者简介]王健,男(1965-),宁夏籍,汉族,主管药师,从事分子疫苗研究。

下抽取囊液,分离原头蚴,经P BS(pH7.2)3次洗涤后,-85℃保存。

1.1.2　质粒与菌种:p GE M-T质粒载体购自Promega 公司。

E.coli JM109由本室保存。

1.1.3　酶与试剂:限制性内切酶BamHI、NotI、X-gal、IPTG、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自Promega公司,DNA回收试剂盒、200bpDNA和Lamb2 daDNA/hindⅢMarker购自北京华美公司。

1.1.4　RT-PCR引物:通过互连网G eneBank中检索的细粒棘球蚴EF-1基因序列设计一对引物: PrimerI:5’ATGG ATCCATGG AGTCGG CGTACATG CG3’ PrimerⅡ:5’GTG CGG CCG CTTACAGTTTGTTAAAGG AAG3’为了便于亚克隆,在引物1和引物2的两端分别引入了一个BamHI和Not I酶切位点。

引物由北京三泰兴隆科技公司合成。

1.1.5　仪器设备:PCR仪(美国BI O RAD),超低温冰柜,超净工作台,电泳仪,凝胶成像分析系统,低温高速离心机,恒温培养箱,纯水仪,电子分析天平,高速匀浆器,热压消毒器,恒温干燥箱。

1.2　方法1.2.1　细粒棘球蚴原头蚴总RNA的提取:取冻存的原头蚴200mg,按试剂盒说明抽提总RNA。

1.2.2　逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):其方案为: 5×Bu ffer10μl,10mm ol/L dNTP1μl,25mm ol/L MgS O4 2μl,AM V1μl,T fI1μl,引物1和引物2各2μl,RNA2μl, DEPC水29μl。

反应条件为:48℃45min,94℃2min; 94℃30s,60℃p GE M-T连接载体1min,68℃2min,40个循环;68℃7min。

待反应结束后,通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.2.3　PCR产物的纯化:用DNA胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的PCR产物。

1.2.4　扩增片段/p GE M-T/JM109的构建纯化的目的DNA与p GE M-T载体在T4连接酶的作用下,4℃连接过夜。

连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞,将其涂布于预先铺有IPTG和X-gal的Y T(含AMP)平板上,37℃培养过夜4。

1.2.5　重组质粒的鉴定:经蓝白斑筛选,挑选白色菌落扩增培养,碱裂解法提取重组质粒,用BamHI和Not I酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.6　序列测定及分析:扩增片段重组质粒的序列测定由大连宝生物公司进行,将测序结果在NC BI/ G enBank数据库进行blast比较和分析。

2　结果2.1　EF-1基因的扩增:RT-PCR扩增出特异性基因片段,大小约为693bp,与预期结果一致,见图1。

1.EF-1基因扩增产物 M.DNA M arker图1　EF-1基因RT-PCR扩增产物2.2　扩增片段/p GE M-T/JM109重组DNA克隆体系的构建及鉴定:PCR产物与p GE M-T载体连接,构建了扩增片段/p GE M-T/JM109重组质粒克隆体系。

经酶切鉴定,得到了大小约为693bp的DNA片段,见图2。

2.3　EF-1基因序列的测定及分析:测序结果表明该基因开放阅读框为693bp,经同源性比较发现,与已发表的EF-1基因(G enBank序列号:AF093621)核苷酸序列相比,有4个碱基的不同,同源性为99%,见图3,推导编码氨基酸序列有4处不同,同源性为99%,见图4。

证明该片段为细粒棘球蚴的EF-1基因片段。

M1.DNA M arker　mbdaDNA/H indⅢ1.未酶切重组质粒2.双酶切重组质粒3.EF-1基因RT-PCR扩增产物4.p GE M-T空质粒图2　扩增片段/p GE M-T重组质粒的酶切鉴定2.4　推测氨基酸序列分析及同源性比较:测序鉴定的目的基因序列在Internet上的G enebank/Blast进行氨基酸序列的比较分析。

结果表明肽链由244个氨基酸残基组成,与已发表序列相比有4处氨基酸组成不同,同源性为98%。

3　讨论近年来,基因工程疫苗在病原生物学中的研究取得了很大进展。

并且在疟疾病和日本血吸虫病疫苗研究中取得了可喜的成绩。

但是对包虫病来说,基因工程疫苗的研究起步较晚,研究水平相对滞后。

为了进一步开展包虫病基因工程重组疫苗的研究,寻找适宜的抗原候选基因是一项最基本的工作。

EF-1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质,在基因表达的翻译过程中起重要作用5。

EF-1可能由α、β、γ、δ四个亚基组成。

其中EF-1α属于G蛋白家族,它和氨酰tRNA、G TP 一起组成复合体,通过正确的识别mRNA上的密码子和tRNA上的反密码子,负责转运氨酰tRNA到80S 核糖体,并具有低水平G TP酶的活性。

EF-1β具有鸟甘酸交换活性,在EF-1α从核糖体离开并且构象由G DP形式变成G TP准备与新的AA-tRNA相互作用的过程中,需要EF-1β作为一种催化剂。

EF-1γ常与EF-1β形成复合物,具有增加后者鸟甘酸交换的功能。

至少在脊椎动物中,EF-1还有第四个亚基EF-1δ,尤其在其羧基端与EF-1β具有同源性,而在氨基端无同源性,表明它们可能具有不同的功能。

Query :RT -PCR 扩增片段　Sbjct :G eneBank 发表序列图3　EF -1核苷酸同源性比较Query :推测氨基酸序列　Sbjct :G eneBank 发表序列图4　EF -1氨基酸同源性比较本研究利用生物信息学技术通过Internet 检索到G eneBank 发表的细粒棘球蚴基因序列,通过RT -PCR 方法扩增出一个693bp 的基因片段,并且成功构建了扩增片段/p GE M -T/JM109克隆体系。