胶原液晶膜的制备及对细胞生长的影响

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及其与细胞相互作用以及材料液晶特性与生物体生命活动的相互影响的机理探讨 . ~ 胶原主要存在于动物 的皮 、 骨、 软骨 、 牙齿 、 肌腱 、 韧带和血管中, 是结缔组织极重要的结构蛋白 质, 在组织工程中具有 良好生物活性和生物降解性能.胶原分子是典型的两性 聚电解质 , 为三股螺旋 结构 , 可以呈现液晶态. i u .ul 等 发现胶原溶液呈扭曲液晶相 , Gr dG i a l e 并利用氨气 中和固定 了胶原 的液 晶取 向.B seu等 。 究发现 在不 同浓 度 的酸溶性 胶原 溶 液 中能 观察 到类 似 肌腱 中皱 褶 形 貌和 esa 。 研
2 结 果 与讨 论
2 1 胶原液 晶膜 织构 观察 .
图 1为样 品的偏 光显微镜 ( O 照 片.可见 ,当胶原溶 液浓 度为 5m / L时 , P M) gm 材料 为各 向同性 的 无序 态 , 用偏 光显微 镜观察 不 到双折 射现象 ;当胶 原 浓度 达 2 em 0m, L时呈 现 出黑 白相 问 的预胆 甾型 /
行 为 的影响 .该方 法能 有效用 于液 晶态 支架材 料 的制备 , 液 晶态 胶原 在 生物 医用 材 料 中的应 用提 供 为
了一定的实验基础 , 为开发新型仿生生物材料提供 了新思路.
1 实验 部 分
1 1 试 剂 与仪器 .
I 型胶原 ( 实验室 自提取 ) 高糖 D E ; M M细胞培养基 ( yl e 司) 新生牛血清( i o Hcn公 o ; Gb 公司) c ; 3( 5二 甲基噻 唑-)25二 苯基 四氮 唑溴 盐 ( TF A rso公 司 ,美 国) .4,一 2 .,. M , m ec ;罗 丹 明一 笔 环 肽 细胞 骨 鬼
高 等 学 校 化 学 学 报
4℃冰箱中备用. 用注射器抽取一定量的各浓度胶原溶液于单晶硅片上 , 用干净的圆形盖玻片均匀加
压 制成 薄膜 , 至充 满 05mo L乙酸溶液 蒸气 的密 闭罐 中平 衡 4 ,移 至充 满氨 气 的密 闭罐 中中 移 . l / 8h后 和 2 ,最后用 蒸馏 水洗 至 中性 . 4h 122 胶 原 液 晶膜 的织构 及 形貌 观 察 . . 将各 浓 度 薄膜 置 于 载玻 片 上 , 在偏 光 显微 镜 的载 物 台 上 , 放
( u poe PR s r h T e o 司) 酶联免疫检测仪( K , hr o A t r e a c , hr 公 o bC ee m ; M 3 T e 公司) 激光共聚焦荧光显微 m ;
镜 ( S 5 0, al e s 司 ) L M 1 CrZ i 公 s .
1 2 实验过程 .
观察薄膜的织构. 将各薄膜冷冻干燥 , 喷金后用 S M观察形貌. E 123 胶 原 液 晶膜 的拓 扑结构 观察 分别将 浓度 为 5 2 . . , 0和 4 gmL胶 原溶液 所制 备 的薄膜置 于原 0m / 子力显微镜基底上 , 观察薄膜 的拓扑结构.表面形貌 图像在 Tpi 模式下获得 ( ap g n 扫描频率 3N m) 在 %脱脂牛奶中( 结合非特异性蛋白 1 .鬼笔环肽中贮存液用 1 4o C) h %牛血清 白蛋 白( S 稀释成工作液后室温染色 2 i, B A) 0rn 再用 P S冲洗 2次, a B 最后用 D P 复染细胞核 1 i AI 0m n
后上 机观察 , 照组 为 圆形 盖玻 片. 对
浸 泡 过夜后 , 培养 基吸尽 .将 鼠成纤 维细 胞 3 3调整 密度 为 2 l elm 吹匀 , 将 T xO C l L, / 每孔加 入 1 mL细 胞 悬液 , 于 3 置 7℃ , %C 培养 箱 中培养 , 隔 1d更换 培养 液. 5 O 每 12 5 细胞 黏 附及增 殖 .. 利用 MT T法 考察 3 3细胞 在各 种薄 膜上 的黏附 情况 .分别 抽取 适 量体 积 的 T 5 0 5 2 ,1 ,1 , 0和 4 gm 0m / L的胶原溶 液 , 备成 薄膜 , 持 每 张薄膜 的胶 原含 量 为 05mg 制 保 . ,细胞 接 种 密度调 整为 2 1。 e/ L 培养 3 n后分别 弃去 培养 液 ,用 P S轻轻洗 去材料 上未 贴 附的细胞 ,加 ×0 C l  ̄ , l 0mi B
基金项 目: 国家 自然科学基金( 批准号 : 178 2 和教育部博士学科点基金 ( 3 00 5 ) 批准号 : 08 5 90 1 资助. 20 0 50 0 ) 联系人简介 : 周长忍 , , 男 博士 , 教授 , 博士生导师 , 主要从事生物 医用材料方面的研究 . ・ a :c 9 n .d .n Em i t z@jleu c l r i
Fg 1 P i. OM h te f etr f h olgnfms o i n l g ict n10 ) p ooso xu eo ecl e l ( r ia manf ai 0 t t a i g i o x
C net t n f h ol e oui s ( g・ ) A)5 B 0 C) 0 o cnr i s tecl gnsltn/ m mI :( ao o a o ;( )2 ;( 4 .
中图分类号
液晶是一种介于液相和固相之问的中间相, 自 是 然界流动性和有序性的有机结合…. 生物体 内的 生物膜及 4大组成物质( 蛋白质、 核酸 、 脂类 、 多糖等) 由于其分子链上含有苯环或能够形成氢键的极
性 基 团及不对 称原 子 , 在溶 液 中多呈棒 状或扁 平状 液 晶态 J .越来 越 多 的研究 关 注于 液 晶态生 物 材料
5 6 7 8 9 m ¨
N .2 o 1
唐敏健等 : 原液晶膜的制备 及对细胞生长的影响 胶
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步说明细胞具有沿着胶原纤维排列的方向取向伸展 , 将有利于形成结构优 良的组织.相关研究结果表 明, 材料拓扑结构能引起间接的机械传导过程 , 即当细胞伸展或形态改变时, 这种细胞张力改变的信 号通过由黏着斑 、 细胞骨架 、 G蛋白和酪氨酸激酶等组成 的一个高度复杂的信号传导级联过程进行传 导, 改变了基因转录从而改变细胞行为¨ 一般认为 , ” . 拓扑结构诱导细胞变形的程度越大 , 因组 基 的应答越大.因此深入研究材料表面与细胞之 间的相互作用机制是改进 和设计新 一代生物材料的关 键.细胞与材料表面间的相互作用通过调控免疫反应和与周围组织的连接强度决定着组织工程材料的 应用 , 而材料表面拓扑结构是影响其相互作用的一个重要因素. 参 考 文 献
唐敏健 ,丁 珊 ,闵 翔 , 焦延鹏 , 周长忍 , 李 红
(暨南大学材料科学 与工程 系,人工器官与材料 教育部工程研究 中心 ,广州 5 0 3 ) 16 0
摘要
从仿生角度出发 , 制备 了一系列液晶态胶原薄膜. 采用偏光显微镜 、 扫描 电镜 和原子力显微镜分别研
究 了各种膜 的液晶织构 和拓扑结构 , 并通过 3( ,. 甲基 噻唑-)2 5二苯基 四氮唑溴盐 ( I ) .4 5二 2 _,. M 法及细胞 r r
架 染料 ( iim公 司 ) 4,. 基 _一 吲 哚 ( A I Ivtgn公 司 , 国) 其 它均 为分 析纯试 剂. Bou t ; 6二脒 2苯基 D P,nioe r 美 ; 偏 光显 微镜 ( H.,Oy p s 司 ) B 2 lm u 公 ;扫 描 电 子 显 微 镜 ( X M—L3 ,P ip 公 司 ) E E X -0 hl s i ;原 子 力 显 微 镜
致 密骨 中 的超 分子 结构 .生 物材 料性能 以及 表面 拓扑结 构 ( 表面 的粗 糙度 、沟槽 的尺寸 和取 向等 ) 对细 胞 的黏 附 、伸展及 生物 相容性 的影 响很 大 h .本研 究 主 要 通过 不 同浓度 的胶 原 溶 液制 备 出 具有 预 J
胆 甾型及胆甾型结构的薄膜 , 考察其织构 、 拓扑结构及 生物相容性 , 并探讨薄膜表面形貌对细胞生长
Vo . 2 13
21 0 1年 1 2月
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C MI ALJ HE C OURNAL OF CHI NES E UNI VERSTI I ES
No 1 .2
2 91~2 9 8 8 5
胶 原 液 晶膜 的制备 及 对 细 胞 生 长 的影 响
组为 空 白细胞培 养板 .
12 6 细胞 生长 形貌 及细胞 骨 架观察 ..
3 3细胞在 5 2 T , 0和 4 / L的胶原 薄膜 上培 养 2 ,弃 0mgm 4h后
去培 养液 , P S冲洗 2次 , 入 25 ( 用 B 加 .% 质量分 数 ) 的戊二 醛 固定液 于 4q C固定 1h 弃 去 固定 液 , , 用 P S冲洗 1 , B 次 梯度酒 精脱 水 , 干燥 , 喷金后 置于 S M 下观察 细胞 在各 种薄膜 材料 上 的生长形 貌 , 照 E 对 组 为 圆形 盖玻 片.将 3 3细胞 在 5 2 T , 0和 4 / L胶原 薄膜 上培养 2 , 去培养 液 , 预冷 P S 0mgm 4h后 弃 用 B 冲洗 2次 , 37 % ( 在 ,5 质量 分数 ) 甲醛 溶 液 中( ) 的 4 固定 1 i, 05 ( 量分 数 ) TinX一 0 5rn 在 . % 质 a 的 ro 1 t 0
入 0 2m . L培养 液 和 0 0 T母 液 ( 5me m T的 P S , .4mLMT 即 , LMT / B ) 孵育 4h后 加入 0 2mL0 0 o L 。 . 4m l /
盐酸化异丙醇溶液, 使生成 的甲臌充分溶解.吹打均匀后每孔吸取 20 0 L至 9 6孔板中, 用酶标仪测 定 50n] 7 i 处溶液的吸光度值 , 3 m为参考波长, l 以60n 对照组为空白细胞培养板.
骨架荧光染色观察研究 了各种膜对 鼠成纤维 细胞 3 3的黏 附、 殖以及形 貌的影 响. T 增 结果表 明 , 原液 晶薄 胶 膜呈现典 型的胆 甾型液 晶织构 ,与非 液晶薄膜相 比,它不仅能更 好地促进 细胞 的黏 附、生长及增殖 ,而且其