感受态细胞制备与转化的实验报告

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第 1 页 共 1 页 感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]

制备感受态细胞的试验报告

试验目的把握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。

试验原理

1.感受态细胞的概念

重组DN分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使之无性生殖并高效表达外源基因或直接转变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DN分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

? 所谓的感受态，即指受体〔或者宿主〕最易接受外源DN片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所确定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cMP可以使感受态水平提高一万倍，而C2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。

制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积15%的无菌XX油或-70℃

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DN或以其为载体构建的重组DN导入细菌体内，

使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等讨论领域的基本试验技术之一。

受体细胞经过一些特别方法〔如：电击法，CCl2等化学试剂法〕处理后，使细胞膜的通透性发生改变，成为能容许外源DN分子通过的感受态细胞。进入细胞的DN分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

化学制备法：

大肠杆菌的转化常用化学法〔CCl2法〕，该法最先是由Cohen于1972年发觉的。其原理是细菌处于0℃，CCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DN形成抗DNse的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞外本文格式为Word版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。

一、实验目的

本实验旨在通过生物瞬时转化技术，将外源DNA片段导入大肠杆菌中，验证转化效率，并观察转化子表型的变化。通过此实验，加深对基因工程操作流程的理解，掌握大肠杆菌的转化方法，并学习如何检测转化子的表型。

二、实验原理

生物瞬时转化是一种将外源DNA片段导入大肠杆菌等原核生物中的常用方法。该过程通常包括以下步骤：

1. 制备感受态细胞：将大肠杆菌在特定的培养基中培养至对数生长期，然后使用CaCl2处理，使细胞成为感受态细胞。

2. 外源DNA片段的制备：将待转化的DNA片段进行纯化，并使其成为一定浓度的溶液。

3. 转化：将感受态细胞与外源DNA片段混合，在适当的温度下保温一段时间，使DNA片段进入细胞内。

4. 恢复培养：将转化后的细胞在适当的培养基中培养一段时间，使其恢复正常生长状态。

5. 验证转化：通过PCR、测序等手段检测转化子的表型，验证转化效率。

三、实验材料

1. 大肠杆菌菌株：E. coli DH5α

2. 感受态细胞制备培养基：LB培养基

3. 外源DNA片段：目的基因片段

4. CaCl2：氯化钙

5. 转化试剂：DNA-LiAc法

6. PCR试剂：DNA聚合酶、dNTPs、引物等

7. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、超净工作台等

四、实验步骤

1. 制备感受态细胞： - 将E. coli DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，菌液浓度为OD600=0.5-0.6。

- 4℃下，5000r/min离心5分钟，弃上清。

- 加入1ml冰冷的CaCl2溶液，重悬细胞。

- 4℃下放置30分钟，使细胞成为感受态细胞。

2. 制备外源DNA片段：

- 提取目的基因片段，纯化后测定浓度。

3. 转化：

- 将感受态细胞与外源DNA片段混合，4℃下放置30分钟。

- 42℃下热激45秒。

- 立即置于冰上冷却2分钟。

第1篇

一、实验目的

1. 理解基因工程转化实验的基本原理和方法。

2. 掌握基因工程转化实验的操作步骤和技巧。

3. 通过实验，验证基因转化效果，为后续研究提供基础数据。

二、实验原理

基因工程转化实验是将目的基因导入受体细胞的过程。根据受体细胞的不同，转化方法也有所区别。本实验采用农杆菌介导转化法，将目的基因导入植物细胞。

三、实验材料

1. 受体植物：小麦植株

2. 转化质粒：含目的基因的质粒

3. 农杆菌：具有转化能力的农杆菌菌株

4. 实验试剂：氯化钙、CaCl2溶液、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗菌素等

5. 实验仪器：超净工作台、无菌操作箱、移液器、离心机、培养箱、显微镜等

四、实验步骤

1. 农杆菌活化与扩大培养

（1）将冻存的农杆菌菌株复苏，在含有抗菌素的LB培养基中扩大培养。

（2）将培养好的农杆菌转移到无菌条件下，用移液器吸取适量菌液，加入含有转化质粒的LB培养基中。

（3）将菌液在摇床上振荡培养过夜。

2. 农杆菌转化

（1）将小麦叶片进行表面消毒，用无菌移液器吸取适量菌液，滴在叶片表面。

（2）将叶片放入无菌培养皿中，在黑暗条件下共培养3-5天。 3. 农杆菌侵染与再生

（1）将共培养后的叶片转移到含有抗菌素的培养基上，进行再生培养。

（2）待再生植株长出后，进行筛选，去除未转化植株。

4. 转化植株PCR检测

（1）提取转化植株的总DNA。

（2）设计目的基因的引物，进行PCR扩增。

（3）观察PCR产物，判断转化效果。

五、实验结果与分析

1. 农杆菌活化与扩大培养

实验中，农杆菌菌株在LB培养基中生长良好，菌液呈均匀浑浊状。

2. 农杆菌转化

共培养后，小麦叶片出现明显的不定芽，表明农杆菌已成功侵染植物细胞。

3. 农杆菌侵染与再生

再生培养过程中，部分植株长出不定芽，表明农杆菌已成功转化植物细胞。

4. 转化植株PCR检测

PCR检测结果显示，部分转化植株扩增出目的基因片段，表明基因转化成功。

分子生物学实验报告

实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化

班级：生工xxxx

姓名：xxx

学号：xxx

日期：xxx

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1 引言

在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法

2.1 实验原理

质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium

chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2 处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。