感受态细胞的制备及转化
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实验五 感受态细胞的制备及转化
一、目的
掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理
所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。
三、试剂与仪器
（一）试剂
1．0.1mol/L CaCl2 称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）
3．LB固体培养基（见实验一）
4．氨苄青霉素（100mg/ml）
（二）仪器
1．冷冻离心机 2．平衡天平 3．无菌操作台
4．微量移液器 5．高压灭菌锅
四、操作步骤
（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)
1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种） 到50 ml LB中 (37℃，预热), 扩大培养。应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值 （此培养只做测量OD600值用， OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。置于4℃存放。12小时内使用效果最佳。
（二）质粒对大肠杆菌的转化
1．取两只1.5ml离心管，分别标记为S（学号）、CK（学号）。
2．分别加入100μl制备好的感受态细胞，冰上放置10min。
3．S管中加入1μl小量制备的质粒，冰浴10min。
4．42℃热激90秒。
5．冰浴3分钟。
6．加入800μl LB液体培养基，37℃培养45分钟。
7．取两个培养皿，分别标记为S、AP（学号，日期）；CK、AP（学号，日期）。
8．取S和CK各100μl 涂布在作好标记的培养皿中。
9．37℃倒置培养16~20小时。
