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基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。
它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。
CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。
以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。
识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。
目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。
2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。
修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。
crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。
合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。
3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。
转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。
转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。
4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。
为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。
最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。
5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。
最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。
此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。
总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。
通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。
细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。
当细胞生长到50％-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系:(6cm盘)2。
4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基.混匀后室温静置10—15min孵育。
3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。
4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。
5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。
6.再过6h加入G418，进行筛选(始终在6cm盘中进行）,使用G418浓度：600µg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。
7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变,只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半.筛选出稳定表达的cell。
8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加入培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm 盘增殖。
2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。
9.单克隆鉴定:提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。
10.先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分.所需物品:1。
转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3。
24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6。
G418 7. 1mlHEPES液。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞培养转染技术的使用注意事项细胞培养转染技术是生物学、医学研究中常用的一种技术手段，它通过引入外源DNA或RNA分子到目标细胞中，实现对细胞功能的改变和基因表达的调控。
在进行细胞培养转染技术时，需要注意以下几个方面的事项，以确保实验结果的准确性和可重复性。
1.选择合适的细胞株和培养条件在进行细胞培养转染技术之前，需要选择适合的细胞株和培养条件。
不同细胞株对转染方法的适用性有差异，因此要根据实验目的选择合适的细胞株。
此外，要做好细胞的预处理工作，保证细胞的健康状况和培养环境的稳定性。
2.选择合适的转染试剂和方法在细胞培养转染技术中，选择合适的转染试剂和方法是非常重要的。
常见的转染试剂包括化学试剂、病毒载体和电穿孔等，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择转染试剂时，要考虑到实验目的、细胞类型，以及试剂对细胞的毒性影响等因素。
同时，要根据实验需要选择合适的转染方法，如瞄准细胞核或质粒转染等。
3.优化转染条件转染过程中的能量和试剂浓度等条件对转染效率有重要影响。
因此，需要进行一系列的优化实验，以确定最佳的转染条件。
可以尝试不同的试剂浓度、转染时间和培养温度等参数，以提高转染效率并减少毒性和非特异性效应。
4.合理设计实验对照组在进行细胞培养转染技术时，应合理设计对照组。
对照组是用来验证实验结果的重要组成部分，它通常包括阴性对照组和阳性对照组。
阴性对照组是指未转染或使用空载体转染的细胞，用以排除实验结果中的背景噪音和非特异性效应。
阳性对照组是指已知有效的转染试剂或方法，用来验证实验的可行性和准确性。
5.合理设计实验时间和重复次数在进行细胞培养转染实验时，需要合理安排实验时间和重复次数。
通常情况下，要在不同时间点收集样本并进行分析，以确定转染效果的持久性和稳定性。
此外，为了提高实验结果的准确性和可靠性，建议进行适当的重复实验，统计分析结果的差异性。
6.正确选择检测方法和时间在转染后，需要通过合适的方法检测目标基因或蛋白的表达情况。
磷酸钙-DNA共沉淀法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。
此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
1、配液(1)2×HBS 1.63g NaCl1.19g Hepes0.023g Na2PO4、2H2O加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌(3)TE：0.1mmol/L EDTA1mmol/L Tris-HCL PH8.0(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。
(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。
2、操作步骤[方法一]：(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。
如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。
(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特定的小干扰RNA (siRNA) 分子来抑制目标基因的表达。
本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程，以及该技术的应用和优势。
二、材料与方法1. 细胞培养：选择合适的细胞系，如人类癌细胞系HeLa，细胞应保持在优良的培养条件下，并处于快速增殖期。
2. 转染试剂：选择适合的转染试剂，如lipofectamine 2000等，根据试剂说明书进行操作。
3. siRNA设计与合成：根据目标基因序列设计合适的siRNA，确保siRNA具有高效的靶向作用和沉默效果。
4. 细胞培养基和缓冲液：准备含有适当浓度的无血清培养基和缓冲液。
三、操作流程1. 处理细胞：将细胞用适量的培养基悬浮在培养皿中，使细胞密度达到合适的转染浓度，一般为60-80%的细胞密度。
2. siRNA与转染试剂复合：将设计好的siRNA与转染试剂按照试剂说明书中的比例混合，并在室温下静置一段时间使其形成复合物。
3. 转染操作：将复合物缓慢滴加到细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿以保证复合物均匀分布在细胞上。
4. 培养细胞：将培养皿放入培养箱中，以适当的条件（如37℃，5% CO2）培养细胞一定时间，以便siRNA能够有效进入细胞并起到沉默目标基因的作用。
5. 细胞分析：根据实验需要，在转染后一定时间内收集细胞，进行相应的实验分析，如蛋白质检测、细胞增殖实验等。
四、应用与优势细胞siRNA转染技术广泛应用于生命科学研究中，可用于研究基因功能、新药靶点筛选、疾病机制探究等领域。
该技术的优势在于操作简便、效率高、靶向性强，并且可用于多种细胞系，适用范围广泛。
五、结论细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，通过引入siRNA分子抑制目标基因的表达。
本文介绍了细胞siRNA转染的操作流程和相关应用及优势。
随着该技术的不断发展，相信它将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
关于细胞转染实验，这些你应该知道细胞转染目前已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。
本文整理了一些关于转染实验前的准备工作及一些实验过程中的小贴士，希望这些信息能够帮助各位科研君们做好转染实验及提高实验效率。
① 从健康细胞开始Ⅰ 转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。
这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
Ⅱ 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。
如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。
我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。
Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。
可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
* 非酶类细胞分离溶液，其配方是螯合剂的专利配方，可温和分离组织培养物的贴壁细胞。
性质比胰酶更温和。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。
部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。
传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
② 进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ 开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ 计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA(0.5–1 µg/µL)。
细胞转染转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
常规的转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主的染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24—72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。
尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。
外源DNA整合到染色体中的概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH：新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂的比例、细胞数量、培基及检测时间等。
转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：1、转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最合适实验设计的转染试剂。
当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。
2、细胞状态一般低的细胞代数（<50代）能确保基因型不变。
最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。
因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
细胞转染成功与否的八大要素第一篇：细胞转染成功与否的八大要素细胞转染成功与否的八大要素摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，转染的成功均取决于知己知彼，方能百战不殆。
做细胞转染也一样道理。
细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。
要素一：细胞分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。
因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。
贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。
相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。
这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。
因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。
传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。
某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。
因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。
一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。
细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。
干细胞稳定转染的步骤1.选择合适的载体：选择适合干细胞转染的载体，常用的有携带选择标记基因的质粒载体或病毒载体，可以根据实验需要选择不同的载体。
2.DNA的准备工作：将所需的外源基因片段克隆到载体中，并根据需要设计适当的启动子和终止子。
确保DNA质粒提取纯度高，并使用合适的工具加以验证。
3. 细胞准备：选择合适的干细胞，常用的有胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)、诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)等。
干细胞需要在培养基中进行适当的扩增和传代。
4.干细胞培养：将干细胞在无细胞培养基中培养，以保持其干性。
培养基中添加相应的生长因子和细胞因子来促进细胞生长和增殖。
5.转染干细胞：将准备好的质粒载体与干细胞一起转染进入干细胞中，常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒介导转染法。
根据研究需要选择合适的转染方法。
6.选择转染细胞：转染后，使用选择性抗生素或选择性标记物来选择转染成功的细胞，例如使用抗生素筛选，只有带有外源基因的干细胞才能在含有抗性抗生素的培养基中存活。
7.干细胞稳定化：将选中的转染细胞继续在无细胞培养基中培养，并经历几个传代。
在这个过程中，通过监测外源基因的表达情况来确定是否稳定表达。
8. 验证外源基因的稳定表达：使用适当的表达分析方法（如PCR、Western blot和荧光显微镜等），检测外源基因的稳定表达情况。
确保外源基因能够在转染的干细胞中稳定地表达。
9.功能验证：在转染干细胞中验证外源基因的功能。
根据实验需要，可以通过细胞增殖实验、细胞分化实验等来验证外源基因的功能。
10.数据分析和报告编写：整理和分析实验结果，并按照科学报告的形式撰写报告，描述实验过程和结果，包括外源基因的稳定表达情况和功能验证结果。
以上是干细胞稳定转染的一般步骤。
需要根据实际情况和实验要求调整和优化步骤，确保转染成功率和所需的目标基因的稳定表达。
磷酸钙-DNA共沉淀法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。
此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
1、配液(1)2×HBS 1.63g NaCl1.19g Hepes0.023g Na2PO4、2H2O加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌(3)TE：0.1mmol/L EDTA1mmol/L Tris-HCL PH8.0(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。
(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。
2、操作步骤[方法一]：(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。
如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。
(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。
②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。
③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。
(4)转染受体细胞①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。
②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。
③置37℃ 5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。
④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。
⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。
同时设有未能转染的对照细胞。
⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。
⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。
本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。
而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。
若以获取“转化灶”为目的，可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的DNA导入受体细胞即可，其方法如下：3、DNA转染[方法二]：(1)配制磷酸转染液NaCl 8.0gHepes 5.0g 用时现配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌-20℃贮存备用加温水至1000mL(2)按前面介绍的方法提取癌细胞DNA。
(3)取供体DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸钠，使最终浓度至0.3M混匀。
(4)再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟，去上清。
(5)加入转染缓冲液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结)，置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊兰色时，即可用于转染细胞。
(6)取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4小时，更换培养液(5ml/瓶)1次。
(7)转染：向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小时。
(8)培养：弃去培养液，用15%甘油处理3分钟，无血清培养漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。
(9)检测：逐日观察，待出现“转化灶”后，分离，扩大培养建立转化细胞株。
脂质体介导DNA转染法脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2～24小时)。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤[方法一]：(1)：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105个液，37℃CO2培养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2)转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。
(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。
(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。
②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。
(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14～24小时，(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时。
(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。
(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞筛选法进行。
DEAE-葡聚糖转染法DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时)，又可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。
方法如下：(1)接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105CO2/孔/皿生长2～3天，当达50%板底面积可用。
(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo质粒DNA，空气干燥后溶于40μL的TE中，或取供体DNA。
(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生长因子血清的DMEM洗板(皿)。
(4)在80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)细胞中，使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色，培养4小时。
(5)从孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室温放置1分钟，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培养液(10%血清的DMEM)。
(6)培养细胞，在适当时间分析细胞，若含有抗药基因，可用G418选择培养液培养，方法同前。
众所周知，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。
而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。
实验设计的三要素和六原则一、实验设计的“三要素”1）实验对象。
实验所用的材料即为实验对象。
如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象，或称为受试对象。
实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。
一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。
最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。
样本过大或过小都有弊端。
2）实验因素。
所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。
影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。
