乙肝病毒核酸检测实验操作流程

1、目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。

2、原理本试剂盒采用乙型肝炎病毒(HBV)-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,利用针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒(HBV) DNA的定量检测。

整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆样本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒(HBV) -核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免了常规样本核酸提取过程中的环境污染。

PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。

PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒（HBV）内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。

3、试剂保存及有效期试剂应避光密闭保存于-20±5℃。

试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。

采用泡沫加冰运输5天不会影响产品效期。

4、样本要求4.1. 适用样本类型:血清或血浆样本。

4.2. 样本采集:4.2.1 血清样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml, 注入无菌收集管，室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5ml灭菌离心管中备用；4.2.2血浆样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，待样本自行析出血浆，或直接1600pm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5ml灭菌离心管中备用。

HBV-DNA核酸扩增及产物分析标准操作程序一、目的：规范实验室操作，正确使用ABI-5700荧光定量PCR仪进行HBV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。

二、适用范围：乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、ABI-5700荧光定量PCR仪。

三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。

四、程序：1、PCR扩增1）打开稳压器电源，再打开计算机电源。

2）打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。

3）将循环条件设定为4）检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

5）将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好反应孔位置。

6）关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。

7）扩增结束后先保存结果，再关闭扩增仪电源，取出PCR 反应管，密封放入垃圾桶。

2、产物分析1）基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。

2）阈值的设定：原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

3）对照标准：阳性对照参控品的Ct值应小于28，标准曲线的拟和度应大于等于0.990，否则视为定量结果无效；阴性、空白对照的扩增曲线应平坦，Ct值等于30或0，否则结果无效。

4）结果判断：检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。

5）填写检验记录，关闭计算机。

此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。

乙肝病毒DNA检测乙肝病毒DNA指的是脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA的浓度越高，病毒的复制越活跃。

合起来，HBV-DNA指的就是乙肝病毒的脱氧核糖核酸。

乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。

一般的，把数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。

乙肝两对半并不能准确的判断病毒复制情况，DNA弥补了这个的不足。

不过由于DNA检测技术要求严格，容易受到干扰，因此，一次结果不足以说明问题，遇到阳性，可以换医院再次检查。

目录1DNA检测2作用3临床意义4复制过程▪第一步：黏附▪第二步:脱壳▪第三步：入核▪第四步：转录▪第五步：翻译▪第六步：逆转录▪第七步：组装5频率6注意事项7检测方法8检测报告9检测费用10检测要空腹吗11乙肝病毒DNA检测的作用1DNA检测以往乙肝患者抗病毒治疗的指征是：乙肝病毒e抗原阳性（大三阳）患者HBVDNA数值要求达到10的5次方拷贝/毫升（20000U/ml），乙肝病毒e抗原阴性（小三阳）患者乙肝病毒DNA数值要求达到10的4次方拷贝/毫升（2000U/ml），但是10的4次方拷贝/毫升以下也不能认为就没有问题了，最新的国际研究资料表明：和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。

2作用目前，乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中使用的越来越普遍，可见乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中占的分量越来越重，这是因为乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用。

主要表现在以下七个方面：1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。

2、乙肝病毒是否复制。

3、乙肝是否传染，传染性有多强。

4、是否有必要服药。

5、肝功能异常改变是否由病毒引起。

乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。

2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。

3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。

3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。

3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。

4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。

另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。

5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。

5.3样品保存和运送使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。

分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。

6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。

乙肝核心抗原核酸检测原理
乙肝核心抗原（HBcAg）是乙型肝炎病毒（HBV）感染时产
生的一种特定抗原。

乙肝核心抗原核酸检测可以用于检测乙肝病毒感染的早期阶段以及病毒血症的监测。

乙肝核心抗原核酸检测原理基于核酸扩增技术。

具体步骤如下：
1. 样本处理：从血液或组织样本中提取乙肝病毒核酸。

2. 逆转录：将病毒RNA转录成对应的DNA，即病毒RNA的
逆转录过程。

3. 嵌合酶链反应（LAMP）或聚合酶链反应（PCR）：使用特
异性引物和酶，在合适的温度下，对乙肝病毒核酸进行多轮扩增，从而产生大量的目标DNA分子。

4. 检测：通过荧光探针或其他荧光染料，对扩增的目标DNA
进行检测。

如果乙肝核心抗原核酸存在，检测结果将显示阳性荧光信号。

该检测方法具有高度的特异性和灵敏性，能够快速准确地检测出乙肝核心抗原核酸的存在，对乙肝病毒感染的早期诊断和监测具有重要意义。

乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程一、引言乙肝病毒核酸检测是一种重要的手段，用于乙肝病毒感染的早期诊断和监测治疗效果。

本文档旨在描述乙肝病毒核酸检测的标本采集、送检和处理流程，以确保流程规范和结果准确性。

二、标本采集1. 标本选择：乙肝病毒核酸检测的标本可使用血清、血浆或乙肝病毒DNA提取物。

根据实验室提供的要求和使用的方法，正确选择合适的标本进行采集。

2. 采集器具：使用无菌器具进行标本采集，如无菌收集管、无菌采血针等。

3. 采集流程：- 患者应事先了解采集流程与注意事项，并保持合作配合。

- 消毒部位：消毒患者采血部位，通常选择肘弯处的静脉。

- 采血：按照相应的方法采集合适数量的血液样本。

注意血液采集的整洁和标本不得受到污染。

4. 采集注意事项：- 采血前需要对采血设备进行消毒处理。

- 采血时要避免对血液标本造成不必要的污染，防止样本交叉感染。

- 采血后进行适当的处理，确保采血点不出现血肿或其他并发症。

三、标本送检1. 样本存放：采集的标本应放入防漏、密封良好的中。

若需要长期保存，应在-80℃低温条件下保存，以防止DNA的降解。

2. 标本信息：在标本上标注清楚患者信息，如姓名、年龄、性别等。

确保标本信息准确，以避免混淆和误诊。

3. 快递选择：选择快递公司进行标本运输，确保安全、快捷的送达实验室。

在包装标记时，应注明标本的特殊性质，以提醒运输人员注意。

四、标本处理1. 样本分装：实验室收到标本后，根据实验要求进行样本分装。

如分装到提取试剂盒、酶解管中，标注清楚样本编号，确保实验过程的可追溯性。

2. 提取和纯化：根据实验方法进行标本的提取和纯化操作。

确保提取和纯化过程的洁净，避免外源性核酸污染。

3. PCR扩增：将提取纯化后的样本进行PCR扩增反应。

注意PCR操作条件的准确性，避免扩增过程中的交叉污染。

4. 结果分析：根据PCR扩增结果，通过相关分析方法，如凝胶电泳、定量PCR等，对乙肝病毒核酸进行检测和分析。

乙肝病毒e抗体诊断操作规程
一、操作步骤：
1、将试剂盒从冰箱中取出至室温中平衡30分钟后使用。

2、将标本对应微孔按顺序编号。

3、每孔加入待测标本50微升，设阴、阳性对照
各两孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔。

4、每孔加入酶结合物1滴，（空白对照孔除外）
充分混匀，封板，置37度孵育30分钟。

5、手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，
静置5秒，甩干，重复5次后拍干。

洗板机洗板：选择洗涤5次程序后拍干。

6、每孔加显色剂A、B液各1滴，充分混匀，
封板，置37度孵育15分钟。

7、每孔加终止液1滴，混匀。

8、用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双
波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。

二、结果判断：
Cutoff Value计算：
COV=阴性对照平均OD值+阳性对照平均OD值/2标本OD值大于等于COV为阴性，标本OD值小于COV为阳性。

三、注意事项：
1、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。

2、封片不能重复使用。

3、结果判断须在反映终止后10分钟内完成。

4、不同批号的试剂不可混用。

5、待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。

6、试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。

乙肝病毒核酸扩增荧光检测1．目的：保证HBV DNA检测结果准确、可靠。

2．适用范围：HBV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。

3．负责人：操作人：原理：本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测乙型肝炎病毒cDNA。

4．性能参数：检出低值＜5×102基因拷贝/ml。

5．标本要求：（1）标本类型：血清。

（2）标本采集：见标本采集手册。

（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。

室温运输。

（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。

6．容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管7．所需设备：SLAN-96P、自动核酸提取仪、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯8．试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；HBV-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×103～5×104基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；HBV 标准品Ⅰ～Ⅳ（1000μl/管）；阴性质控品（250μl/管）1管。

9．校准程序（计量学溯源性）：送芜湖市计量检测所校准。

10．程序步骤:：11.1试剂准备：按操作说明执行，将磁珠充分混匀；裂解液室温过低时易出现结晶，请放置于37℃环境至晶体融解，结合液含有不容的球型颗粒，混匀后即可使用；洗涤液W中已经加入了乙醇，不需要再加乙醇（注意保存时确保将瓶盖拧紧，以防止乙醇挥发）。

11.2自动核酸提取仪：如下表所示分装试剂，若使用上海之江生物医药科技有限公司核酸自动提取仪进行提取，选择“HBV-25ul或者DNA/RNA-2”规程进行提取，若使用其他匹配仪器根据建议设置核酸提取仪参数。

液→样本→蛋白酶K的顺序加入液体。

乙肝五项检测操作规程乙肝五项检测(乳胶法)(一)检测目的乙型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAh、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。

(二)测定原理HBsAg、HBsAh、HBeAg均采用双抗体(原)夹心法原理。

用抗HBsAg多克隆抗体包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记的抗HBs鲰单克隆抗体HBsAh，应用双抗体夹心法原理，定性检测血清／血浆中HBsAg；用HBsAg重组抗原和链霉亲和素一BSA包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记的HBs如重组抗原和生物素一BSA及其他试剂，应用双抗体夹心法原理，定性检测血清／血浆标本中HBsAb；用抗HBeAg单克隆抗体(Ehl)包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记的抗HBeAg单克隆抗体(Eh2)。

应用双抗体夹心法原理，用于定性检测血清或血浆中HBeAg。

HBsAg、HBsAb、HBeAg测试时，将血清／血浆标本滴人试剂板加样处．标本在毛吸效应下向E层析，如标本中含有相应的待测物质，在测试区(T)内会出现一条红色条带，则是阳性结果。

如标本中不含有相应的待测物质，则测试区(T)将没有红色条带，是阴性结果。

无论待测物质是否存在于标本中，一条红色条带都会出现在质控区内(c)。

质控区内(c)所显现的红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

HBeAh、HBcAh采用竞争法原理。

用HBeAg重组抗原包被硝酸纤维素膜，配以乳胶标记的鼠抗HBeAg单克隆抗体。

应用竞争抑制法原理，定性检测血清／血浆巾HBeAI，；用HBcAg重组抗原包被硝酸纤维素膜，配以乳胶标记的HBcAb单克隆抗体，应用竞争抑制法原理，定性检测血清／血浆中HB。

Ah。

测试HB。

Ah、HBcAb时，将血清／血浆标本滴入试剂板加样处，随之标本在毛吸效应下向上层析。

如标本中含有相应的抗体．则同膜上测试区(T)的单克隆抗体竞争与预包被在乳胶颗粒上的相应抗原反应。

如标本中没有相应的抗体，预包被在乳胶颗粒上的相应抗原则同膜上测试区(T)的单克隆抗体全部结合。

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

乙型肝炎快速检测标准操作程序介绍本文档旨在提供一份乙型肝炎快速检测的标准操作程序，以确保检测过程的准确性和一致性。

以下是详细的操作步骤。

步骤1. 检测前的准备：- 检查所有试剂和设备的有效期，并确保其完好无损。

- 准备所需的乙型肝炎快速检测试剂盒和其他必要材料。

2. 样本采集：- 培训有关人员，并确保他们了解正确的样本采集方法。

- 使用标准的检测工具，如无菌注射器或针头，采集血液样本。

- 将采集的血液样本放入适当的中，确保不发生样本交叉污染。

3. 样本处理：- 依据乙型肝炎快速检测试剂盒的说明书，正确处理血液样本。

- 快速检测试剂盒通常需要一定的时间与样本反应，确保按照指定时间进行操作。

4. 结果解读：- 在规定的时间内，解读样本的反应结果。

- 遵循乙型肝炎快速检测试剂盒的说明书，对结果进行准确判断。

- 记录结果，并按照机构的政策进行存档或报告。

5. 清洁与消毒：- 使用符合卫生标准的清洁剂对实验现场进行清洁。

- 根据处理乙型肝炎血液样本的具体要求，对使用过的设备进行消毒或处理。

6. 结束步骤：- 在完成检测后，关闭设备，并按照所使用材料的特定要求进行妥善处置。

- 进行实验室设备的常规维护，以确保其日常可靠性和操作性。

注意事项- 在整个操作过程中，必须使用个人防护装备，如手套和口罩，以避免交叉污染和保护检测人员的安全。

- 根据检测试剂盒的说明书，注意操作温度和其他特定要求。

- 结果的解读应由经过培训的专业人员进行，确保正确解读结果。

- 定期检查试剂和设备的有效期，并按照相关规定进行更换和更新。

以上是乙型肝炎快速检测的标准操作程序，希望能为您提供帮助。

在执行任何检测程序之前，请确保您已充分了解相关操作步骤和安全要求。

乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。

3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。

5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。

5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。

5.3 性能参数：5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。

5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。

5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：血清。

5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。

5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。

5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。

5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

乙肝dna检测的操作规程
乙肝DNA检测的操作规程主要包括以下步骤：
1. 采集血液样本：通过抽取受检者的静脉血液来获取样本。

建议在空腹状态下进行抽血，以提高检测的准确性。

2. 提取DNA片段：利用特定的设备和技术，如EV卸电泳、PCR等，从血液样本中提取出乙肝病毒的DNA片段。

这一步骤是检测的关键环节，需要使用精密的仪器和专业的操作。

3. 比对和分析：将提取出的DNA片段与标准样本进行比对，通过特定的检测方法，如荧光定量PCR、基因测序等，分析DNA片段的特性和序列，以确定乙肝病毒的种类和复制程度。

4. 得出检测结果：根据比对和分析的结果，得出乙肝病毒DNA的定量或定性检测结果。

通常情况下，检测结果会以数字或阴阳性方式呈现。

5. 报告与解读：将检测结果整理成书面报告，并提供给医生或受检者。

医生根据检测结果判断受检者是否感染乙肝病毒，以及病毒的复制程度和传染性。

受检者应遵循医生的建议进行相应的治疗或监测。

需要注意的是，乙肝DNA检测是一项高技术含量的实验，需要由经过专业培训的医务人员进行操作。

同时，乙肝病毒的检测结果解读需要结合其他相关检查结果和临床表现进行综合分析，因此最好在医生的指导下进行。

2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。

2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。

2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。

2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。

2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。

（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。

为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。

获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。

）3 .加样（在样本处理区进行）3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。

3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。

4 .PCR扩增（检测区）4.1 循环条件设置使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：1150℃2min无2195℃9min无34595℃15sec无58℃50sec单次采集荧光4138℃10sec无■阴性对照无定量值出现，且内标Ct值W40；■强阳性对照检测值范围(3.16X105-3.16X106),临界阳性对照检测值范围(3.16×101-3.16×102),且内标Ct值W40。

乙型肝炎病毒核酸定量检测1原理本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（TAQ酶）、核苷酸单体（DNTPS）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。

2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1标本种类：血清或血浆。

2.1.2标本要求：血清——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000rpm离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。

血浆——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000rpm离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML 进口灭菌管2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与—20℃待测，保存期为6个月。

2.3标本运输：密封，室温运输。

2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

3试剂3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。

3.3 包装规格：20人份/盒3.4 试剂盒组成DNA浓缩液，DNA提取液，PCR反应管，HBV临界阳性质控品，HBV强阳性质控品，阴性质控品，HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml、1.0×105 IU/ml、3.5试剂储存条件及有效期：-20℃避光保存，有效期6个月。

4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(Ⅱ级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温金属浴。

4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技术公司、广州达安基因有限公司。

4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。

5 操作步骤5.1 DNA提取：5.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同）-取100ul血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5sec；12，000rpm离心10min；去上清，沉淀中加入30ul DNA 提取液，振荡器剧烈振荡混匀5-10sec，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±1min；12，000rpm离心5min，备用。