鹅细小病毒的分子生物学研究进展_蒋运博

鹅细小病毒感染雏鹅研究禽类MHC对细胞之间的相互作用实行免疫调节，其结构与疾病防控研究密切相关1。

MHC是编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群，存有高度多态性，能适合和抵抗绝大多数病原微生物2。

病原体驱动的选择是有利于MHC杂合子，表明MHC基因型和与宿主的抗病性或免疫应答水平密切相关。

MHCⅠ类等位基因与诸多疾病相关，并且复杂性和多态性使个体间的免疫应答有所不同3。

当前主要研究鸡和鸭的MHC，而鹅的MHC研究较少，鹅的MHCⅠ存有高度多态性4，MHCIIβ片段来自不同的MHCIIB基因座5，MHC基因间存有着复杂的功能及协同互作，为此本试验分析GPV感染雏鹅的MHC多态性变异，以期为进一步研究鹅的易感性及抗病机理奠定基础。

1.1试验动物随机选择生长一致、健康的3日龄雏鹅，由青岛农业大学莱阳五龙鹅实验基地提供。

1.2.1雏鹅处理将种毒GPVYZ经口腔接种6日龄的雏鹅，每只接种0.2mL，感染组雏鹅（YZ）。

同时对照组雏鹅（CK）接种等量的生理盐水，连续观察发病症状，分别采集肝脏。

1.2.2制备细胞悬液参照文献6的方法，收集鹅肝脏细胞膜。

1.2.3膜蛋白的提取参照文献7的方法，用TritonX-100抽提膜蛋白，丙酮沉淀，PEG6000浓缩，冷冻真空干燥粗膜蛋白。

1.2.4MHC的分离纯化PBS溶解粗蛋白样品，上样于经同样缓冲液平衡的SephadexG-200柱脱盐，梯度（0～0.6mol/LNaCl，PBS0.02mol/L）洗脱，收集合并活性蛋白部分，再上样于预先用pH值6.3100mmol/LPBS平衡的BioGelP-100凝胶柱纯化，用PBS（pH值6.3，100mmol）洗脱，收集纯化的MHC，冷冻真空干燥。

1.2.5蛋白质含量检测总蛋白含量，参照文献8，以BSA为标准，紫外法检测，总蛋白含量（mg/mL）=1.55×A280-0.76×A260，系数F1=1.115，系数F2=0.76；MHC的含量，参照鹅MHCⅠ/Ⅱ酶联免疫分析试剂盒（上海沪鼎生物科技公司LOT10-45-618）实行测定，λ=450nm。

462020年第9期 吉林畜牧兽医·禽业专栏·QinYe ZhuanLan免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究于昌贵天津市中升挑战生物科技有限公司，天津 300380摘 要：利用免疫酶组织化学染色法将雏鹅进行人工感染GPV，在不同阶段病毒抗原在体内的分布状况具有不同的特点，采用影像学技术对其予以定量分析后，雏鹅于感染1～21 d 可在各器官中检测到病毒抗原体，而其中在5 d 时，感染分布较为广泛，因此抗原出现染色效应的最大，待检组织中空肠具有较高的检出率，而病毒抗原因此广泛存在消化道的各种上皮细胞中，由此可知上皮细胞为GPV 重要的靶细胞。

关键词：鹅细小病毒；间接免疫酶组织化学法；染色强度鹅细小病毒（GPV）在细小病毒科中可诱发鹅细小病毒病，是一种可感染雏鹅或者番鸭的传染性疾病[1]。

此疾病多发于3～20 d 内出生的雏鹅。

目前，小鹅瘟在流行趋势以及发病特点上具有较为新颖的观点。

1 试验方法1.1 动物分组与病毒接种准备将66只14 d 雏鹅随机分为2组，观察组（感染GPV）40只，对照组26只。

观察组中对雏鹅予以肌肉注射0.1 mL、口服0.5 mLGVP 尿囊液；另一组予以统计量的生理盐水。

1.2 取样将GPV 感染的雏鹅进行不同时段取病变样本，将所有病变组织进行标记后可在-20 ℃予以保存。

1.3 免疫组化法的应用主要通过进行优化后的间接免疫酶组织化学法对其进行处理，可将样本进行切片在载玻片上固定后，进行胰蛋白酶修复以及洗涤切片，当完成标本制作后，在电风扇下将标本吹干或利用温箱烤干标本，若二甲苯表现出透明性状，则可予以树胶封片。

1.4 定量分析对染色样本的阳性强度检测，若强度表现高，则代表阳性征具有更强的效果，本次结果以“均数±标准差”表示。

2 感染原因与结果分析2.1 不同时段的器官组织病变动态分析检测组织诊断主要应用免疫酶组织化学染色后，在电子显微镜下对其进行切片，再对感染结果进行分析。

鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建及其免疫原性摘要小鹅瘟是由鹅细小病毒（GPV）引起的一种急性或亚急性传染病，1~2周龄雏鹅死亡率高达90~100%，严重危害养鹅业的健康发展。

GPV是细小病毒科的重要成员，VP3蛋白是构成病毒衣壳的主要结构蛋白，能诱导机体产生中和抗体。

因此，VP3蛋白成为小鹅瘟基因工程疫苗研制的首选靶蛋白。

本研究通过PCR方法扩增GPV的VP3基因，将其重组至腺病毒载体，在体外包装成能够高效表达VP3蛋白的重组腺病毒，并观察其免疫原性，旨在为研究GPV重组活载体疫苗奠定基础。

（1）VP3基因的重组穿梭质粒的构建：以pDC-VP3重组质粒为模板，采用PCR 方法扩增获得长度为1605 bp的VP3基因，并将其克隆至穿梭质粒pacAd5 CMV K-NpA，获得重组穿梭质粒pacAd-VP3。

（2）VP3重组腺病毒的构建：经Pac I线性化的pacAd-VP3及骨架质粒pacAd5 9.2-100在脂质体介导下共转染HEK293AD细胞，获得重组腺病毒rAd-VP3。

rAd-VP3连续传代至F6代，病毒效价可达10-8.23/0.1 mL TCID50。

（3）rAd-VP3的鉴定：用RT-PCR可从rAd-VP3扩增到长度1605 bp的DNA片段；用Western blot在rAd-VP3感染的HEK293AD细胞培养物检测到分子量大小约57 kD的特异性蛋白条带，该蛋白可与GPV抗血清特异性结合；用rAd-VP3感染的HEK293AD细胞和鹅胚成纤维细胞（GEF）经GPV抗血清和荧光标记的山羊抗小鼠IgG染色后，细胞内均呈现绿色荧光。

上述结果表明，VP3基因能在HEK293AD和GEF中高效表达，重组VP3蛋白能与GPV抗血清发生特异性免疫反应。

（4）rAd-VP3的免疫原性：用rAd-VP3免疫SPF级昆明小鼠血清中抗体效价可达1:264，小鼠血清能有效抑制GPV感染GEF引起的细胞病变；rAd-VP3免疫雏鹅14d后能产生较高水平的GPV抗体，免疫后28 d，血清抗体仍维持在较高水平。

新型鹅细小病毒研究进展卞国志1,21，袁建丰2（1.广州 511400）摘 要：，MDPV）引起的一种传染病。

经典MDPV和GPV高。

但是2008年下半年以来，福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地的雏半番鸭和樱桃谷鸭陆续出现一种新型细小病毒病，该病发病率10%~30%，病死率低于3%，临床症状主要为软脚、短嘴和生长障碍。

通过对该病病原进行全基因组测序及系统发育树分析，结果发现该病原与鹅细小病毒亲缘性很近。

本文通过比较新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus，N-GPV）与经典的MDPV和GPV在基因组、感染宿主范围和致病性的区别，为新型鹅细小病毒病的防控提供理论依据。

关键词：新型鹅细小病毒；鹅细小病毒；番鸭细小病毒中图分类号：S852.659.2 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2019）04-0102-06 PROGRESS OF A NOVEL GOOSE PARVOVIRUS VIRUS BIAN Guo-zhi1,2, MA Hai-bin2, LUO Meng-ping2, GONG Feng-ping2, WANG Gui-ping2,LIAO Ming1, YUAN Jian-feng2(1.Veterinary Medicine College of South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2.Guang dong Haid Institute of AnimalHusbandry&Veterinary, Guangzhou 511400, China)Abstract:Duck parvovirus disease is caused by Goose parvovirus or Muscovy duck parvovirus. The main clinical signs of classic MDPV and GPV infections are diarrhea, foot soft and exudative enteritis. The morbidity and mortality of Muscovy ducks are high. However a new type duckling parvovirus (N-GPV) emerged in Mule ducks and Cherry Valley ducks in the second half of 2008 in Fujian, Zhejiang, Anhui and Jiangsu provinces. The morbidity of N-GPV was 10-30% and the mortality was generally below 3%. The clinical signs of N-GPV were foot break easily, short beak and dwarfism syndrome. N-GPV caused serious economic loss to the duck industry in our country. The whole genome sequencing and phylogenetic analysis of N-GPV isolates revealed a similarity to goose parvovirus. This review provided the latest information on host range, genomic analysis, pathogenicity and prevention and control of N-GPV.Key words: Novel goose parvovirus; Goose parvovirus; Muscovy duck parvovirus收稿日期：2018-08-16基金项目：国家重点研发计划（2017YFD0500800）；广州市科技计划项目（201704020083）；广东省科技发展专项资金项目(2016B020234006，2017B090904029)；广东省技术开发及产业化类别（2015B020203006）；广州市科技发展专项资金项目重点项目专题(201804020006)；广东省新型研发机构建设--初创期补贴专题作者简介：卞国志，男，博士研究生，预防兽医学专业；马海彬，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：袁建丰，E-mail：peteryuanfeng@年分离得到该病的病原体鹅细小病毒（G o o s e parvovirus，GPV）[1]。

鹅细小病毒非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区的筛
选的开题报告
一、研究背景和目的：
鹅细小病毒是一种常见的禽类病毒，能够引发水禽的急性呼吸道疾病。

其主要病原是鹅细小病毒（EGPV），目前对其的预防和治疗仍然存在很大的挑战。

因此，研究EGPV的免疫原性对于开发有效的预防和控制方法具有重要意义。

本次研究旨在通过筛选EGPV非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区，探究其免疫原性及作为候选疫苗的潜力。

二、研究内容和方法：
1. 分离EGPV非结构和结构蛋白。

2. 通过生物信息学分析，预测EGPV非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区。

3. 进行 peptide microarray 实验，对预测表位进行筛选，并对阳性克隆进行验证。

4. 将验证出的免疫原性良好的表位区纳入后续免疫试验和疫苗设计中。

三、预期结果和意义：
该研究将筛选出EGPV的非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区，为研究EGPV的免疫原性奠定基础。

预计将筛选出免疫原性较好的多个表位区，为后续的免疫试验和疫苗设计提供参考。

同时，该研究将深入了解EGPV的抗原特性，为新的疫苗
设计提供理论支持，促进EGPV的预防和控制工作的开展。

doi：10.19369/ki2095—9737.2020.06.062鹅细小病毒病的流行、诊断和预防隋欣（黑龙江省鸡西市动物疫病预防与控制中心，黑龙江鸡西158100）摘要：鹅细小病毒病也称为代尔塞病、鹅肝炎、小鹅瘟，是雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性、致死性疾病。

在欧洲和远东的主要养鹅国家都有鹅细小病毒病的报道。

依据特征性的临床过程、发病日龄、大体病变和组织学病变，可初诊。

确诊需经过实验性的病毒分离。

活苗和油乳剂灭活苗用于预防该病％关键词：鹅；细小病毒病；流行；临床表现；病理变化；诊断；鉴别；预防中图分类号：S85&33文献标识码:B1病原鹅细小病毒是细小病毒科的一个成员，最近被证明与人依赖病毒属相关％鹅细小病毒，除与番鸭细小病毒具有密切关系之外，与其他禽类或哺乳动物细小病毒无相似性。

原发感染后，病毒主要在肠壁复制，在经过短暂的病毒血症后，进入心脏、肝脏和其他器官％2传播与流行感染禽经粪便排出大量病毒，直接或间接传播造成发病。

疾病暴发通常开始于感染种鹅经蛋传播给易感雏鹅。

有证据表明，亚临床感染的老龄鹅可能是病原携带者％在之前无该病的国家或地区出现鹅细小病毒病暴发时，感染种蛋通常是病毒的来源％血清学证据表明，欧洲的多种野鹅都存在有该病毒％尚未发现其他禽类带毒者或生物带毒者％3临床表现根据日龄的不同，易感雏鹅和雏鸭的临床症状差异较大。

1周龄之内的禽，病程发展快，伴随有厌食，在2〜5天内出现死亡。

孵化室感染的雏禽，死亡率可达100%。

日龄稍大的禽，病程较长，特征是鼻腔和眼有分泌物，出现腹泻，虚弱％眼睑和尾脂腺红肿％急性期幸存的雏禽表现有生长迟缓，羽毛脱落，皮肤发红，特别是背部皮肤％由于腹腔积液，雏禽常以企鹅状姿势站立％病毒对2〜文章编号：2095—9737（2020）06—0112—024周龄雏禽的致死率可达10%，但发病率可能更高％尽管成年禽可产生免疫应答，但是不表现任何临床症状％4病理变化大体病变有舌头和口腔覆盖有纤维蛋白性假膜、肝周炎、心包炎、肺水肿、肝营养不良和卡他性肠炎。

禽细小病毒分子生物学研究进展
何长生;魏建忠
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2003(024)003
【摘要】鹅细小病毒(GPV)和鸭细小病毒(MDPV)是两种感染禽类的自主性细小病毒,由它们引起的鹅细小病毒病和雏番鸭细小病毒病是目前严重危害养鹅业和养鸭业的主要疫病.GPV和MDPV在形态结构、理化特性、免疫学特性甚至基因组结构等方面十分接近,但是二者在致病性上却有较大差异.对于这种差异,国内外学者从分子生物学角度进行了大量研究.文章主要从这两类病毒的基因组核苷酸序列、非结构蛋白基因、核衣壳蛋白基因、非结构蛋白和核衣壳蛋白的分子生物学上的同源性和差异性进行了综述,同时,对于禽细小病毒有待研究的方面也进行了探讨.
【总页数】3页(P12-14)
【作者】何长生;魏建忠
【作者单位】安徽农业大学畜牧水产学院,安徽,合肥,230036;安徽农业大学畜牧水产学院,安徽,合肥,230036
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
【相关文献】
1.猪细小病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展 [J], 李天芝;于新友;谢金文;沈志强
2.犬细小病毒分子生物学研究进展 [J], 张玉香;李改茹;纪森林;檀济敏;王茹怡;粟硕
3.猪细小病毒分子生物学研究进展 [J], 郭浩;张建楼
4.猪细小病毒分子生物学检测方法的研究进展 [J], 余同江;陈坚
5.禽细小病毒的分子生物学 [J], 章金刚;向华;杜华茂
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2012年3月（上）收稿日期：2011-05-09；修回日期：2012-01-29基金项目：吉林省科技厅发展计划项目（20040206－2－2）作者简介：蒋运博（1985－），女，硕士研究生，bobo_jyb@163．com．通信作者：胡桂学（1963－），男，教授，博士，huguixue901103@163．com．鹅细小病毒的分子生物学研究进展蒋运博，董浩，马磊，徐楠楠，段小波，胡桂学（吉林农业大学动物科技学院，长春130118）中图分类号：S852．65+9．2文献标识码：A文章编号：1004-7034（2012）03－0031－03关键词：鹅细小病毒；分子生物学；小鹅瘟摘要：鹅细小病毒（GPV ）病是危害养鹅业的主要传染病之一。

文章根据国内外对鹅细小病毒的分类地位、分子生物学特性、基因组的结构特点、非结构蛋白与结构蛋白的功能以及分子生物学诊断与防治等方面的研究作一综述，以期为鹅细小病毒及小鹅瘟的防控提供参考。

小鹅瘟是由鹅细小病毒（goose parvovirus ，GPV ）引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病。

该病主要侵害3 20日龄的雏鹅和雏番鸭，以渗出性肠炎、小肠黏膜表层大面积坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变，是一种主要侵害肠、肝脏、肾脏、心脏等实质脏器的急性、高度接触性传染病。

1956年，小鹅瘟病毒首次由中国学者方定一在江苏扬州市发现并分离，是一类无囊膜的DNA 病毒。

1974年，国际禽病学会（WPSA ）将其命名为Derzsys 氏病。

近年来，许多国内外学者从不同角度，对鹅细小病毒进行了分子水平上的研究，更好地认识了鹅细小病毒的生物学特性，促进了对该病的有效防制，文章仅对鹅细小病毒分子生物学方面的研究进展作一综述。

1分类地位及一般特性鹅细小病毒属于细小病毒科细小病毒亚科细小病毒属成员，国际病毒分类委员会将细小病毒科分为2个亚科，即细小病毒亚科和浓核病毒亚科，细小病毒亚科又分为细小病毒属、红病毒属和依赖病毒属。