微生物甾体羟化技术及其应用

羟化反应是甾体微生物转化反应中最重要和最 广泛被应用的反应，主要有２种原因：一方面，羟基 化能够为进一步的化学合成提供中间体；另一方面， 用微生物进行羟基化反应可以达到一般化学反应达 不到的部位，并羟基化后的甾体化合物具有消炎等 方面的活性。例如，最早应用于工业生产的羟化反 应就是利用黑根霉转化黄体酮生成１１ｎ羟基衍生 物”ｏ。甾体微生物羟化反应无论在其多样性或重要 性方面都是独特的，因为它能达到其它方法不能达
收稿日期：２００５—０９一１２ 作者简介：胡海峰．男．生于１９６７年，研究员，主要从事微生物药物的研究与开发。
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微生物甾体羟化技术及其应用胡海峰等
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菌的生长细胞或静息细胞迸行的。无论酶的来源如 何，甾体羟化酶都是一种细胞色素Ｐ４５０依赖的金属 酶，其反应式如下：
ＲＨ＋ＮＡＤＰＨ＋０２＿ＲＯＨ＋ＮＡＤＰ＋＋ＯＨ。 由于这些酶能将１ｍｏＵＬ Ｏ：引入底物，因此被 定义为单氧化酶。这种细胞色素ｉ０４５０依赖的单氧 化酶广泛的存在于几乎所有形式的生命体中，以游 离或膜结合的形式存在。羟基形成机制根据同位素 示踪实验的研究结果证实转化到甾体上的羟基是直 接取代甾体碳架上的氢原子，并且取代过程中没有 产生立体构象的变化，也不是先通过形成烯的中问 体来完成的，也就是说羟基取代的立体构象是由原 来氢原子所占的空问位置决定。经“０：、ＤＯ：及 Ｈ，Ｏ”分别实验确定，羟化作用的氧不来自水中的氢 氧基，而是来自空气中的氧，这一点从理论上说明工 业上用黑根霉转化甾体时需要充分供氧的原因。黑 根酶的羟化反应与温度有密切关系，最佳生长温度 ２６～２８℃，超过３２℃不再生长，主要不发生羟化作 用。黄曲霉（Ｒｎ－４０５）的转酮酶缺陷突变株ＡＦ９６１２ 的最佳培养温度，最佳发酵温度都在２８℃，其中发 酵温度对转化率的影响很显著，升高２℃，转化率下 降１５％～２０％【６ Ｊ。从ＣｙｔＰ４５０类单加氧酶催化机制 看，羟化反应与温度关系密切可能与Ｃｙｔ］？４５０单加 氧酶本身活性中心氨基酸残基对热敏感有关。 １．３弪化反应的研究进展 甾体的羟化发展很快，并在甾体工业上取得了 巨大成果，目前人们在这方面的工作主要在于怎样 进一步降低成本。甾体的水不溶性是困扰整个甾体 工业的问题，解决这一问题的方法主要有３种：第 一，使用有机溶剂，如甲醇、ＤＭＦ、ＤＭＳ０等，但由于 这些溶剂对微生物存在毒性，其浓度往往控制在较 低的范围；第二种解决方式就是环糊精的应用， Ｃｈｉｎｃｈｏｌｋａｒ等研究了在Ｂ．环糊精（１３－ＣＤ）存在时 ＣｕｒｒｕｌａｒｉｖＶＫＭＦ６４４对１１－脱氢皮甾醇（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ Ｓ 化合物，简称化合物ｓ）的１１Ｂ羟化，当化合物Ｓ与 Ｂ—ｃＤ比率为Ｉ．０：０．６时，氢化可的松的产率为 ７０％～７５％（底物浓度为４９／Ｌ），而未使用１３一ＣＤ的 产率只有４０％～５０％【”；第三种解决方法是固定化 细胞等新技术的应用，例如Ｐｅｔｚｌｏｄｔ等首次用Ｐｅｎｉ— ｃｉｌｌｉｚ，＿＿ｍ ｒａｉｓｔｒｉｃｋｉｉ进行１９一去甲基一１３－乙基雄甾４—烯一 ３，１７双酮（ＧＤ）的１５ｄ羟化，其１５ｄ羟化衍生物是 生产口服避孕药△５－Ｄ－十八甲基炔诺酮ｇｅｓｔｏｄｅｎｅ 的重要中间体；将Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｒａ ｒａｉｓｔｒｉｃｋｉｉ４７７固定在藻 酸钙凝胶上制成固定化细胞，在４０ｄ中进行了１０批
表１ 羟化位置
１５ａ １６ａ ６Ｂ １１Ｂ １５Ｂ
催化甾体羟基化的微生物”
微生物名称
Ｆｗａｎｕｍ ｍｏｎｉ＆ｆｏｒｍｅ．ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｗ Ａｓｐｅｒｇｉｌｂａｓ ｏ＆ｒ啦ｅｍ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｂａｓｇｔｔｍｉｇａｔｍ．
Ｒｈｌｚｏｐ‘ｓ ｎｉｇｒｉ衄ｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｌｕｍ ｒａｉｓｍ２３＃ｉｉ
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１．２羟化反应的机制”１ 从广义上讲微生物羟化反应包括由细菌和真菌
催化进行羟化反应，真菌比细菌更广泛的应用于甾 体药物的合成。进行羟化反应的酶可以有不同来 源，包括植物和动物细胞。因为酶难以分离和酶的 不稳定性，应用游离酶进行羟化反应并未得到广泛 应用，事实上大部分甾体微生物羟化反应是利用真
到的部位。 在甾体微生物羟化反应中，１ｌｏｔ、１１１３、１５０ｔ和
１６０ｔ羟化反应因其能产生皮质甾类化合物及其类似 物，而受到较多关注０１。１ｈｘ、１１８和１６Ⅸ羟化反应 一般分别由根霉菌属、曲霉菌属、弯孢霉菌属、小克 银汉霉菌属或链霉菌属催化（表１）。１１羟基对于抗 炎的活性是必不可少的，而甾体的１６０ｔ羟基能够提 高糖（肾上腺）皮质激素的活性。此外，１１Ｂ羟基被 ｃｌ原子代替时并不会导致其与肾上腺素受体问亲和 能力的丧失，这就使１１Ｂ羟基化合物能够作为药物 的有效中间体。
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生产，在生产几批后将定化细胞在营养培养基中 再生可以使１５ｅＬ羟化活性完全恢复。“。
阳葵等报道了极性生长调节剂（ＷＳＴＪ—Ｉ型）的 添加对绿僵菌羟化１６ｄ，１７ａ一环氧黄体酮反应活性 的影响，当培养基中含０。０２５％的生长调节剂对，摇 瓶菌体对２９／１０００ｍＬ底物转化６０ｈ后，转化率达 ８０％以上，而对照仅５０％左右。实验选用的生长剂 是硝基酚钠类一元酚的混合物，由于霉菌细胞在生 长初期细胞壁一般很薄，利于酚类调节剂以非离子 形式向细胞内扩散、渗人产生作用”ｏ。生长调节剂 可能改变了细胞膜透性。对于生物来说，磁场是一 种物理刺激因素，磁场的生物效应多种多样。阳葵 等对将磁化水处理菌种的技术应用于甾体微生物转 化进行了尝试。具体考察了磁化水处理菌种对微生 物羟化１６ｎ，１７ａ一环氧黄体酮转化反应的效应。磁 化处理条件为：磁场强度０．２４—０．２５Ｔ、静置式磁 化、作用时间３０ｒａｉｎ。研究表明经磁化水处理的绿 僵菌菌种，对底物１ｌａ羟化能力有明显改善，其效应 与添加适量生长调节剂相当。两者配合使用，提前 投人底物时效果加强，这有利于发酵周期的缩短。 磁化处理后菌种的优良特性可在传代中保持至第３ 代‘”１。
根据ＴＬＣ分析结果如图４所示，ＳＩＰＩ－４４的转化 率可以达到５０％，但副产物较多；转化过程仅为一 步反应。
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圈２推测转化反应流程图
３展望 微生物羟化技术的发展不仅促进甾体药物的发
展，也提高了药物代谢研究的水平，具有重要的价值 和意义。微生物羟化技术的重要应用之一就是甾体 药物合成中的羟化反应，不仅能够完成化学合成难
［１２］Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ ＬＬ，Ｎｉｓｓｅｎ—Ｍｅｙｅｒ Ｊ，Ｓｐｉｌｓｂｅｒｇ Ｂ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｌａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ６－ａｒｙｌｐｕｒｉｎｅｓ：ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅ－
析等。
关键词：微生物转化； 甾体；羟化反应
中国分类号：Ｒ９７７ １
文献标识码：Ａ
甾体是指具有类似四环结构的一类化台物如胆 固醇、麦角甾醇、孕甾烯和雌二醇等，其对性功能调 节、糖代谢、脂肪代谢、蛋白质合成、矿物质代谢等具 有重要的生理功能，ｆ临床上使用的甾体药物包括抗 炎症药、利尿药、治疗白血病和心血管病药、治疗更 年期综合征药和抗肿瘤药等”’２ Ｊ。尽管对甾体药物 的研究历史较长，但目前对甾体药物的研究仍然具 有重要的价值和意义。研究的主要目标是提高甾体 药物合成的收率；利用微生物转化法制备采用化学 方法难以合成的甾体类化合物。采甩现代生物技术 改造微生物转化中所采用的转化菌以提高酶的活力 和加强酶反应的选择性并发展提高甾体底物水溶性 的技术及酶和微生物细胞的固定化技术等以提高微 生物甾体羟化的转化率。微生物酶系催化台成甾体 化合物的反应有多种，主要有羟基化反应、甾体边链 水解反应和脱氢反应等。其中羟化反应研究和应用 最为广泛，本文将主要概述微生物甾体羟化技术及 其在甾体药物合成中的应用。 １ 甾体的羟基化反应 １．１概述
、
２甾体羟基化反应的应用实例 作者实验室对甾体的微生物转化研究已取得一
定的成绩，主要是甾体的羟基化反应如去氢表雄酮 的双羟基化反应和坎利酮（ｃａｎｒｅｎｏｎｅ）的羟基化反 应研究，下面主要介绍微生物转化法应用于这２个 甾体羟基化的实例。 ２．１微生物转化合成７Ⅸ，１５ｄ—Ｚ－羟表雄酮””
Ｙａｓｍｉｎ（屈螺酮加炔雌醇）为先令公司开发成功 的口服避孕药，已经在美国和欧洲上市。７“，１５ｎ一二 羟基雄烯醇酮（７ａ，１５ｄ—ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｄｒｏｓｔｅｎｏｌｏｎｅ）是 合成屈螺酮的重要中间体。应用亚麻刺盘孢（Ｃｏｌｌｅ— ｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｉ）的羟化酶系统对去氢表雄酮底物进行 生物转化，合成了７ ｏ【，１５ａ一二羟基雄烯醇酮，可采用 直接转化法和间接转化法。实验结果表明，直接转 化与间接转化的转化率均在６０％一７０％，但间接转 化的副产物少（见图１），提取和纯化收率高。直接 转化方法简单，工业化生产仍然使用直接转化法。 ２．２坎利酮生物转化的研究
国外医药抗生素分册２００６年３月第２７卷第２期 文章编号：１１３０１—８７５１（２００６）０２—００７６—０３
微生物甾体羟化技术及其应用
胡海峰 李晓敦 朱宝泉 （上海匡药工业研究院，上海２０００４０）
摘要：微生物甾体转化技术已经成功地应用于甾体药物的研究与生产中，特别是甾体的羟化技术。本文主要
概述微生物甾体羟化反应的机制、研究进展和应用实例介绍，包括去氢表雄酮的双羟基化反应和坎利酮转化产物分
坎利酮化合物具有利尿功能和肾上腺皮质激素 受体拮抗的功能，对其结构修饰和筛选获得临床治 疗心血管疾病药物一Ｅｐｌｅｒｅｎｏｎｅ，其中关键的１１位 羟化反应可以由微生物转化完成。为了获得其新的
结构衍生物，我们利用赭曲霉羟化酶系统对坎和酮 进行转化研究，发现不同的赭曲霉羟化酶对坎利酮 进行转化形成多个转化产物，包括１５一羟基坎利酮， １１一羟基坎利酮和１１一羟基＿６，７一二氢坎利酮等化合 物。我们对其中１株转化菌ＳＩＰＩ－４４进行研究，分离 出１５一羟基坎利酮和ＩＩ一羟基６，７－二氢坎利酮２个化 合物的样品，通过ＭＳ、ＮＭＲ等图谱数据分析，确定 这２个化台物的结构，其中１５一羟基坎利酮的转化未 见文献报道。