电穿孔简介演示文稿

MicroPulser 电穿孔仪操作手册2018 年12 月27 日1、介绍（1 ）基本原理MicroPulser 电穿孔仪用于细菌、酵母和其他众多微生物的电击转化，转化时，高压电脉冲作用于悬浮在小体积高阻介质中的样品。

本系统由一个脉冲发生器（pulse generator ）模块、一个电击腔（shocking chamber ）和一个装有电极的电击杯（cuvette ）组成。

样本放置于电击杯的电极之间。

MicroPulser 模块包含一个电容器，将电容器充电至高电压，然后模块将电容器中的电流放电到试管中的样品中。

MicroPulser 的电容放电电路产生具有指数衰减波形的电脉冲，如下图。

当电容器放电至样品时，跨越电极的电压迅速上升至最大电压（or 峰值电压，peak voltage ；也称为初始电压，Vo ），并随时间（t ）减小，如下式：其中τ=R · C，为时间常数，是脉冲长度的简便表达式。

R 为电路电阻，单位为ohms （欧姆）。

C 为电容，单位为microfarad （微法拉）。

根据方程1 ，τ是电压下降至峰值电压1/e （~37% ）的时间。

MicroPulser 的内部电路被设计以使E.coli 、酿酒酵母及其他许多微生物可以得到最佳电穿孔，最佳转化效率发生在大约5ms 的时间常数内。

这些电穿孔条件是通过使用10 微法拉电容器和将600 欧姆电阻与样品池并联以及将30 欧姆电阻与样品池串联来实现的。

除时间常数外，电场强度是另一个决定转化效率的重要参数。

电场强度E，是施加于电极间的电压，公式为：其中，V 为施加的电压，d 为电极间的距离，单位为cm 。

电场强度和细胞的尺寸（size ）决定了横贯每个细胞的电压降，正是电压降可能是电穿孔中电压效应的重要表现。

30 欧姆串联电阻的目的是在发生电弧的情况下保护设备电路。

在正常操作条件下，当样本在高电阻介质中，电阻不会影响施加在样本上的电压。

细胞电转染电转的简介 (1)电穿孔转染的基本原理及过程 (1)电穿孔转染条件的选择 (1)1 电参数 (1)2脉冲时程 (2)3 脉冲次数 (2)4 细胞因素 (3)5 质粒因素 (3)6 温度 (4)7．缓冲液以及培养液的成 (4)仪器常用键区介绍 (5)Neon TM电转染一般流程 (7)电转的简介电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。

这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。

它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。

尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。

电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。

其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。

再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。

一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合。

电穿孔转染条件的选择1 电参数电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。

对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。

电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。

电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。

活体电穿孔法介绍1、什么是活体电穿孔活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。

由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。

活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。

在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。

近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。

活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。

大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。

因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。

2、活体电穿孔的法的特点活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。

在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。

如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。

当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。

例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。

其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。

此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。

但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。

Bio-Rad MicroPulser 电穿孔仪的操作及维护规程1、功能介绍 1.1选择预设程序MicroPulser 电穿孔仪预设了常用的微生物电击程序，包括5个细菌和5个真菌电击程序。

如下：按"Settings"键选择"Bacteria"，"Fungi"和"Manual "设置。

当"Fungi "旁的LED灯亮时，预存的真菌转化程序即被调出，按"Raise"和"Lower"键显示出不同的真菌转化程序。

电击的参数自动按显示的程序设定。

同样的，选择"Bacteria "程序相同。

1.2 选择手动模式A. 改变电压按 "Settings" 键，当"Manual"旁的LED灯亮时，显示屏显示电压值 (单位kV)。

按"Raise"和"Lower"键在0.20 kV to 3.00 kV之间改变电压设置。

如果仪器刚刚打开，显示值为"0.00"。

B. 截短脉冲当"Manual"旁的LED灯亮时，同时按"Raise"和"Lower"键LED屏显示“t—”，表示为脉冲选择了时间。

开机时的默认设置为标准的指数衰减脉冲，衰减过程并不被截短，显示为“——”。

同时按"Raise"和"Lower"键后只松开"Lower"键，显示数字为截短的脉冲持续时间，单位为毫秒（ms），从1毫秒开始以0.1毫秒为增量一直到4毫秒。

限定脉冲时间在1-4毫秒之间。

同时按"Raise"和"Lower"键后只松开"Raise"键，可以调整脉冲时间到更短。

图4.15 穿刺焊接
2.穿刺连接技术要求
（1）穿刺时，扁平线缆（或带状电缆）的切割线必须和扁平线缆（或带状电缆）的长度方向垂直。

（2）接插件的长度方向和扁平线缆（或带状电缆）的长度方向必须垂直；
5.0
且扁平线缆（或带状电缆）的宽度与接插件的长度一致、或超出接插件mm 左右。

（3）穿刺时，扁平线缆（或带状电缆）的芯线中心应该对准接插件簧片中心的线槽缺口处，不能错位。

（4）穿刺的位置、尺寸和极性应符合设计图纸要求。

3. 穿刺的检测
4.穿刺焊接的特点：
（1）节省材料。

无须焊料、焊剂和其他辅助材料，可大大节省材料。

（2）不需加热焊接，因而不会产生热损伤。

（3）操作简单，质量可靠。

（4）工作效率高，约为锡焊的3～5倍。

三、归纳、小结
采用提问、启发回答的方式进行小结。

1．了解穿刺技术
2．熟悉穿刺技术的特点
四、作业布置
1．穿刺技术的机理？
2．穿刺技术的特点？。

电穿孔技术原理及其在基础医学研究中的应用作者：周骏贵来源：《商品与质量·学术观察》2014年第03期摘要：电穿孔技术是在瞬时高电压下DNA等小分子物质得以穿过细胞的技术。

近年来，电穿孔技术已经被广泛应用在体内和体外的各项基础医学和临床实验之中，在保持细胞高存活率的前提下，可以大大提高外源物质进入细胞的效率，并促进目标DNA表达，发挥治疗作用。

本文对电穿孔技术的原理、注意事项及应用进行综述，以期为相关研究提供资料支持。

关键词：电穿孔细胞科研基础医学基因治疗一、电穿孔技术的原理电穿孔（electroporation）是指在高强度、短时间的电压作用之下，外源性物质克服细胞膜的阻碍而进入细胞。

电压的强度超过了细胞膜所能承受的阈值，使膜出现瞬时可逆性的结构变化，从而介导了外源性物质的进入。

这个瞬时的可渗透状态不仅导致小分子物质可通过简单扩散大量进入细胞，而且很多大分子物质如染料分子、DNA分子等也可通过电击的介导进入到细胞内部。

过去电穿孔技术的应用往往受制于电击对细胞造成的伤害难以控制，但近十多年来，随着仪器设备的发展和对实验条件的摸索，电穿孔技术已经被广泛应用在体内和体外的各项实验之中，在保持细胞高存活率的前提下，电穿孔可以大大提高外源物质进入细胞的效率。

使细胞膜达到可渗透状态所需要的场强可用以下的公式来表示：ΔVm=fEextrcosФ其中 f为细胞对电压的耐受常数，Eext为外界电压的强度，r为细胞的半径，cosФ为细胞所处位置与电场方向夹角的余弦值。

一般认为，由于细胞膜所带负电荷的存在，可渗透状态的产生率先发生在细胞面向外界电场正极的一侧，细胞膜的脂质双分子层出现瞬时的亲水性的小孔而允许外源物质的进入。

接着细胞面向电场负极的一侧也出现类似的结构，整个细胞进入可渗状态。

在外界电压达到阈值的前提下，控制电击脉冲的时间和次数可控制细胞进入可渗透状态的程度。

脉冲时间的延长和次数的增多可使得细胞膜面向电场正极的一侧可渗透面积加大，同时使细胞膜面向电场负极的一侧可渗透程度加深。

图片简介:用于向组织递送能量的设备、系统以及方法。

具体而言，本技术涉及用于在不导致心律失常效果的情况下在相对较厚的靶组织(诸如，心脏的心室)内增强损伤形成的系统以及方法。

在一个实施例中，可递送电荷中性脉冲以及非电荷中性脉冲以用于诱发增强目标部位处的细胞死亡的电解化合物的形成。

额外地或替代地，在消融组织之前，可将治疗部位处的组织加热至亚致死温度。

技术要求1.一种医疗系统，所述系统包括：第一治疗设备；第二治疗设备；以及能量发生器，所述能量发生器与所述第一治疗设备以及所述第二治疗设备通信，所述能量发生器被编程以用于：递送电荷中性脉冲；以及在所述电荷中性脉冲之间递送非电荷中性脉冲。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述能量发生器被进一步编程以用于以第一幅度递送所述电荷中性脉冲，并且以第二幅度递送所述非电荷中性脉冲，所述第一幅度比所述第二幅度更大。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，其特征在于，所述非电荷中性脉冲是单相和双相中的一个。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述非电荷中性脉冲具有直流电偏移。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述系统被配置成用于将电荷中性以及非电荷中性脉冲递送至靶组织区域，所述非电荷中性脉冲的递送将电荷施加至所述靶组织。

6.根据权利要求1、2、4或5中任一项所述的系统，其特征在于，所述能量发生器被进一步编程以用于以第三幅度递送非电荷中性脉冲，所述第三幅度小于所述第一幅度以及第二幅度中的每一个。

7.根据权利要求1、2、4、或56中任一项所述的系统，其特征在于，所述第一治疗设备以及所述第二治疗设备中的每一个包括至少一个治疗电极，所述至少一个治疗电极被配置成用于插入至靶组织的区域中。

8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述至少一个治疗电极是针形电极。

9.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述至少一个治疗电极是螺旋形电极。

10.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述至少一个治疗元件与流体源流体连通，所述至少一个治疗元件包括多个孔径，所述多个孔径被配置成用于将流体从所述流体源递送至所述靶组织的区域。