外周血染色体核型分析讲义

实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤 四、讨论分析一、 实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。

初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。

通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。

在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。

在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。

但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。

在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。

再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。

最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。

本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。

胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。

通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。

由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。

关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。

二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。

3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。

外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析一、实验目的（1）、熟悉淋巴细胞体外培养原理。

（2）、掌握人体微量血液体外培养技术。

（3）、通过本次实验掌握制备染色体标本的方法。

（4）、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。

（5）、培养学生的自主能力，锻炼学生的动手操作能力。

二、实验原理外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G1期（或Go期）一般情况下是不再分裂的在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞随后进入有丝分裂。

这样经过短期培养秋水仙素的处理低渗和固定就可获得大量的有丝分裂细胞。

本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。

人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。

本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。

在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。

植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。

利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。

最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。

即可得到所需的人体染色体图形。

染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。

临床研究发生。

3.3　适度的皮瓣张力。

在切口缝合的时候,要在充分切除癌可能侵犯的皮肤的基础上,尽量减小皮瓣张力。

如果皮瓣张力高,可以使用皮肤减张的方法缝合。

具体方法包括:①皮肤缺损面积小时,可以采用皮肤网状戳孔法,即用手术刀尖将切缘两侧皮肤切开多个小切口,深度达真皮层,不要全层切开,以防破坏皮下毛细血管网。

当皮瓣缝合以后颜色正常,则停止戳孔。

此法简单实用。

②如果皮肤缺损较大,则采用游离植皮术,一般采用下腹全厚皮片移植。

用刀尖在皮片上多点切开成网状,一可增加皮片面积,二可使皮下的渗血渗液能及时排出,防止移植皮片坏死。

3.4　防止皮下积液。

液体的产生几乎不可避免,如果不能顺畅引流,则可以形成皮下积液,因此尽量减少液体的产生和通畅的引流是防止皮下积液的必然手段[3][4],这些措施包括:防止淋巴管漏、术后双管引流、胸带加压包扎等。

参考文献1　许晋彦.改良乳腺癌根治术后近期并发症分析(附36例报告)[J ].山东医药2007,47(33):67～682　潘俊峰.乳腺癌改良根治术后皮瓣坏死的预防探讨[J ].肿瘤学杂志,2007,13(6):467～4683　毛国璋.乳腺癌根治术后皮瓣下局部积液的治疗体会[J ].医师进修杂志,2004,27(5):564　张艳君.两种包扎法预防乳腺癌根治术后皮下积液的疗效观察[J ].军医进修学院学报,2004,25(5):388～389作者单位:115100　辽宁省大石桥中心医院639对不良孕产史夫妇外周血染色体核型分析张志红　王金兰　孙超英【中图分类号】R596.1 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085(2008)03-0050-03【摘要】目的:探讨不良孕产史与染色体异常之间的关系。

方法:我们对639对不良孕产史夫妇进行了外周血染色体核型分析。

结果:发现79例异常核型,常染色体异常中女性27例,男性6例;性染色体异常46例男性45例,女性1例。

异常检出为率6.18%。

人类外周血培养及染色体核型分析一、实验目的：1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。

二、实验原理：1、植物血凝素的作用外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。

当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。

2、秋水仙素的作用：秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。

因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。

使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。

3、低渗的原理：徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。

这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。

4、核型和带型：核型(karyotype)：是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。

在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。

将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。

带型（banding pattern）即染色体带型。

借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。

染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。

常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。

就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。

三、实验用具及试剂：1.实验仪器及用具：恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。

外周血染色体核型分析项目简介临床应用：用于染色体遗传病的诊断、不孕不育、先天畸形、智障诊断、胚胎植前筛选等。

检测结果的临床意义我国，人口中有20-25%的人患有各种遗传病，其中由染色体病导致的有近1400多万人。

染色体病主要表现为不孕、不育、反复性或自发流产、死胎、生育异常儿、闭经、智力发育不全或智力低下、多发畸形等。

然而，染色体病至今没有特殊、有效的疗法，主要在于预防和早期干预，所以做染色体检查，对于遗传咨询、降低出生缺陷、正确的生育指导及提高人口素质均具有重要意义。

适检人群1.不明原因的生长、发育迟缓，异常面容，多发畸形，身材矮小，两性畸形和智力发育迟缓的病人。

2.不明原因死产和新生儿死亡。

10%是由于染色体异常导致。

3.具有原发性闭经或不明原因的继发性闭经的女性。

4.原发性不育或习惯性流产的夫妇。

约3%～6%的原发性不育或习惯性流产的夫妇，其中一方存在染色体异常。

5.一级亲属中携带已知的或者可疑的染色体异常。

6.肿瘤。

几乎所有的肿瘤都与一条或多条染色体异常相关，肿瘤组织的染色体检查有助于临床诊断和预后评估。

7.高龄妊娠。

孕妇年龄大于30～35岁时，其胎儿染色体异常的风险明显增加，因此应对高龄孕妇的胎儿常规进行染色体分析。

标本采集要求1.采集要求：无菌采静脉血3ml，使抗凝剂与静脉血充分混匀,防止凝固，等待本中心配送人员收取，应在室温4～25℃保存。

采样和送检过程要严格无菌操作，严防溶血、凝血。

2.化疗期间病人和大剂量或长期使用抗生素病人需停药半个月后采血。

3所有样本应在保质期内及时送检（保存24小时）。

过了保质期样本不能保证培养效果。

或通知临床重新抽血送检。

4.如有大量饮酒或有酗酒习惯，采血期间尽量避免。

临床项目收费标准。

人外周血淋巴细胞的分离培养及核型分析一、实验目的1．学习人体微量外周血分离培养的方法2．学习应用培养淋巴细胞进行染色体制片的方法3．了解人类染色体核型的基本特征4．通过对人类染色体组型进行分析，初步学会对染色体进行分析的方法. 二、实验原理人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养,白细胞中含有小淋巴细胞.外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一。

通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现,其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。

外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态.在人工离体培养时,在培养基中加入一定剂量的植物血凝素（PHA）后,小淋巴细胞受刺激可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂.外周血中的淋巴细胞经过68—72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。

用秋水仙素(细胞分裂阻断剂）处理，积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期，从而获得足够的可供分析的中期分裂相。

此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。

核型分析是指在有丝分裂中期，对染色体大小形态、数目测量，进行排队分组分析。

不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。

在显微镜下观察染色体的结构和数量。

正常男性的染色体核型为44条常染色体加2条性染色体X和Y.正常女性的常染色体与男性相同，性染色体为2条XX。

三、实验仪器与试剂1. 实验材料：人外周血淋巴细胞2.实验试剂RPMI“1640”培养基、小牛血清（冰冻保存,用时在56℃水浴条件灭活）、、秋水仙素、植物血球凝集素（PHA）、肝素、生理盐水溶液（500U/ml）、5%NaHCO3双抗（青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml）、2％碘酒、pH6。