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利用微卫星分析家禽的遗传多样性作者：韩雪粟朝芝朱丽莉顾永芬陶宇航来源：《南方农业·下旬》2015年第11期摘要当前，微卫星技术研究为我国的家禽饲养方面提供了科学保障，在研究家禽分子生物学的领域得到社会各界的关注，也是微卫星为家禽分子生物学领域的热点。
为了研究分析广东地区饲养家禽的品种分类的进化、种群遗传的多样性，利用微卫星来进行分析，能够有效进行基因鉴定和系谱分析，并评估鸡群之间的遗传距离。
微卫星通过卫星标记，计算每个等位基因的频率，然后再以等位基因的频率为基础来研究鸡群品种内的遗传变异及家禽品种间的遗传距离。
关键词微卫星；家禽；分子生物学；遗传多样性中图分类号：S813.1 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）33--02微卫星是近几年来应用最多的一种分子标记。
近年来，随着科学技术的发展，利用微卫星分析家禽的品种的遗传多样性也已经成为最主要的研究方法。
微卫星的实验使人们对牲畜生物学的分析和研究迈进了一个新的高度。
其以少数的核苷酸DNA序列，本身具有的高度保守性及位点多态性的特征[1]。
所以在具体的实验中，可以利用微卫星的这种保守性，在一个微卫星的物种研究结果运用到另一物种研究的结果，继而更快、更准确的找到该物种里的更多的微卫星位点。
微卫星的另外一种多态性是目前我国微卫星多数的实践呈现，并且实验分析证明了微卫星的核心序列的重复越大，变异性也大，等位基因数也越多。
1 采取样本1.1 取样方式在实验中的采取样本是实验的基础，而最常见的就是采集血样进行研究。
但是采样是否含有代表性直接的影响到实验的结果。
我国牲畜养殖业历史悠久，由于每个地方性的气候类型不一样，再加上人们的生活习惯有着明显的差异，是我国的牲畜业也体现出来复杂，品种多样，特征不同的各种家禽[2]。
据我国数据统计现存的牲畜品种数量大约就有576种，其中的地方品种就有426个，还有经过改良培育的品种有73个。
在这些牲畜品种由于人们的饲养习惯的不一样，各地区环境差异，这些品种完全处于人们自发、粗放的养殖方式。
基于PCR技术的遗传多样性分析PCR技术是一种常用的遗传分析技术。
通过扩增DNA片段，可以从微小的样本中获得足够的DNA量进行遗传多样性研究。
基于PCR技术的遗传多样性分析已经广泛应用于生态学、进化生物学、农业等领域。
本文将从PCR技术的基本原理、PCR扩增产物的分析和遗传多样性分析方法等三个方面介绍基于PCR技术的遗传多样性分析。
一、PCR技术的基本原理PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，它是从自然界中发现的一种DNA复制机制借鉴而来。
PCR技术的基本原理是在一定的条件下，使用DNA引物（即核酸探针）将目标DNA分子在体外迅速而准确地扩增。
PCR技术中，DNA引物是起到扩增作用的关键因素。
引物应分别与DNA的5’-末端和3’-末端相向而设计，以保证扩增的准确性和特异性。
在PCR过程中，引物和DNA混合在一起，并加入适宜浓度的DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液等试剂。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双螺旋结构被高温变性，使得双链DNA分离成一条条单链DNA；在退火步骤中，引物在一定温度下结合到目标DNA片段的两个末端；在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板在合适的温度下合成互补链，从而形成新的双链DNA。
PCR反应周期性地加热和降温，从而在短时间内迅速扩增目标DNA。
二、PCR扩增产物的分析PCR扩增产物的分析是PCR技术在遗传多样性分析中的重要环节。
如何准确判断PCR扩增产物的质量和纯度是遗传多样性研究的核心问题。
PCR扩增产物的质量和纯度受到PCR反应条件、DNA聚合酶、引物浓度、DNA模板质量和纯度等多种因素的影响。
常用的PCR扩增产物分析方法包括凝胶电泳、测序、RFLP分析等。
其中，凝胶电泳是最常用的方法。
凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。
琼脂糖凝胶适用于小分子量的DNA和RNA分子，而聚丙烯酰胺凝胶适用于大分子量的蛋白质和DNA分子。
SSR分析遗传多样性1 SSR简介简单重复序列，也称微卫星（SSR），其串联重复的核心序列为1-6bp，其中最常见的是双核苷酸重复，即（CA）n和（TG）n，在植物基因组中（AT）n最多，长度一般在100bp以内。
尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计以对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以获得其长度多态性。
SSR标记的高度多态性主要来源与串联数目的不同。
根据分离片段的大小决定基因型，并计算等位基因发生频率。
2 SSR的分类根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基，但两端的连续重复核心序列重复数大于 3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）复合型，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开，但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。
3种类型中完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。
3 SSR在植物基因组中的分布在植物中，平均23.3kb就有一个SSR；双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物，前者两个SSR之间的平均间距为21.2kb，后者为64.6kb；绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。
4 SSR标记的应用目前SSR分子标记已成为系谱分析、分类鉴定、亲缘关系分析、体细胞杂种鉴定、遗传图谱构建、基因定位、育种材料早期选择首选的分子标记之一。
SSR技术已在苹果、梨、桃、杏、葡萄、柑橘、称猴桃、板栗、核桃、樱桃、山植、椰子等果树上有了很多的应用。
影响微卫星分析家禽遗传多样性有关因素的探讨汤青萍;陈宽维;章双杰;李慧芳;屠云洁;赵东伟【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2006(021)001【摘要】微卫星现为我国家禽分子生物学研究领域中的一大热点,在利用微卫星分析家禽遗传多样性时,其试验结果会受到采样、引物选择及数据分析等因素的影响.本文结合自身用30个微卫星对我国76个地方鸡种进行遗传多样性分析时的具体情况分别进行阐述.并指出要克服这些因素的影响,采样时尽量选择有品种代表性的群体,采样数达60羽,公母比1:4;选择的引物应分散在不同的染色体上,引物的个数应不低于25对;在凝胶条带判型时最大限度的减少认为因素;数据分析应用规范、大家广泛使用认可的生物学软件.【总页数】4页(P86-89)【作者】汤青萍;陈宽维;章双杰;李慧芳;屠云洁;赵东伟【作者单位】中国农业科学院家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院家禽研究所,江苏,扬州,225003【正文语种】中文【中图分类】S813【相关文献】1.利用微卫星分析家禽的遗传多样性 [J], 韩雪;粟朝芝;朱丽莉;顾永芬;陶宇航2.微卫星标记在人工养殖小体鲟种群的数据分析方法比较和遗传多样性分析 [J], 董颖;杨瑞;姜志强;胡红霞3.种群微卫星DNA分析中样本量对各种遗传多样性度量指标的影响 [J], 闫路娜;张德兴4.样本量和性比对微卫星分析中群体遗传多样性指标的影响 [J], 包文斌;束婧婷;许盛海;李慧芳;陈国宏5.缢蛏群体微卫星分析中样本量对遗传多样性指标的影响 [J], 牛东红;陈慧;林国文;李家乐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用微卫星标记分析我国西南地区12个地方特色鸡群体的遗传多样性应用微卫星标记分析我国西南地区12个地方特色鸡群体的遗传多样性概述随着农业生产的发展，地方特色鸡种群的保护与研究成为了学术界的关注点之一。
微卫星标记作为一种高变异性的分子标记，已被广泛用于评估物种和种群的遗传多样性。
本研究应用微卫星标记对我国西南地区12个地方特色鸡群体的遗传多样性进行了分析，并对其结果进行了探讨。
方法本研究选择了12个地方特色鸡群体样本，采集了其血液样品。
首先，从该血液样品中提取了基因组DNA，然后根据之前已报道的微卫星标记的引物序列进行扩增。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到了该群体的微卫星型谱。
结果通过对12个地方特色鸡群体的微卫星型谱进行分析，我们获得了大量的遗传信息。
首先，我们计算了每个群体的多态信息含量（PIC），结果显示大部分群体的PIC值在0.5到0.8之间，表明这些地方特色鸡群体具有较高的遗传多样性。
同时，我们还计算了遗传相似系数，并使用聚类分析对群体进行了分类。
结果显示，这12个地方特色鸡群体可以分为3个大的类群，分别是A、B和C类群。
这些类群的构成反映了地理位置的影响，即相近地区的群体更为相似。
讨论通过对我国西南地区12个地方特色鸡群体的微卫星标记分析，我们发现这些群体大部分具有较高的遗传多样性。
这表明我国西南地区的地方特色鸡群体具有比较高的适应力和生物多样性，这对于它们的长期保护和品种改良具有重要意义。
另外，聚类分析结果也反映了地理位置对于群体遗传多样性的影响，这与地域中心性理论相吻合。
具体来说，地理上相邻的地方特色鸡群体更容易发生基因流，从而导致它们的遗传相似度更高。
结论本研究应用微卫星标记分析了我国西南地区12个地方特色鸡群体的遗传多样性，并对其遗传关系进行了研究。
结果显示，这些地方特色鸡群体具有较高的遗传多样性，并且地理位置对其遗传相似性具有影响。
这为地方特色鸡的保护和品种改良提供了基础数据和科学依据，并为进一步研究提供了新的方向。
遗传多样性的分析方法及其在种质资源保护中的应用种质资源是指作为遗传多样性基础的生命资产，是植物和动物的基因质、种子、胚囊、幼苗、组织细胞、骨架等优良元素，在生态与环境保护、农业生产、食品安全、药物研发等方面发挥着重要作用。
保护种质资源，不但能促进优良物种的保存和利用，也能为人类的生产生活做出贡献。
而保护种质资源的核心在于遗传多样性的保护，因此遗传多样性分析也逐渐成为了种质资源保护的重要手段之一。
遗传多样性是种质资源保护的核心，它是指生物种类内各个个体之间遗传变异的差异。
遗传多样性越丰富，就意味着这个物种适应环境、抵御病虫害的能力越强，也就更容易适应因生态环境的改变而带来的生存挑战。
对遗传多样性进行分析，并不仅仅包括了基因的分析，还包括了亲缘关系、种群结构、基因流等方面。
以下将着重介绍遗传多样性分析的几种常用方法及其在种质资源保护中的应用。
1、PCR-SSR技术PCR-SSR技术是一种高效的遗传多样性分析方法。
SSR是指微卫星序列，这种方法通过仪器进行多个基因区域的扩增，使得几千个微卫星基因片段扩增至20-300基对的长度，从而分析出物种内同等基因不同等位基因的数量、型态、基因频率和表型频率等。
这种技术可以在短时间内快速、准确地进行多个引物扩增，获取大量的基因片段。
PCR-SSR技术广泛应用于植物、动物、微生物的遗传多样性分析中。
2、RFLP技术RFLP技术是通过核苷酸链断裂酶（restriction endonuclease）水解DNA，生成不同的DNA片段，再通过电泳技术将其分离，经过染色而被观察到。
这种方法可以检测出基因组中的多态性，对不同基因型共有的限制性内切酶切位点，进行Elecrophoresis分析，以分类，如亲缘关系，种群结构等。
这种技术在遗传多样性分析中有着重要的应用。
是其他技术无法替代的。
3、AFLP技术AFLP是基于PCR扩增出来的DNA序列，通过限制性内切酶切割和PCR扩增，获得多个特征DNA分子，随后将这些特征分子进行电泳分离和检测即可。
全基因组范围内的微卫星多态性分析技术微卫星多态性分析技术是在全基因组范围内进行的一种重要的分子生物学技术。
该技术主要利用微卫星序列的高度可变性，通过PCR扩增等方法，建立微卫星多态性分析体系，并通过对分析结果的比对，对物种、个体间的遗传关系、多样性、进化历史等问题进行研究。
本文将介绍全基因组范围内的微卫星多态性分析技术的研究现状和应用的前景。
一、微卫星多态性分析技术的发展历程微卫星是一种由重复的2-6个碱基序列组成的短片段DNA，长度在10-50个碱基对之间。
由于微卫星序列的高度可变性，其在全基因组中具有广泛的存在性，且不受编码区限制。
微卫星重复次数的改变可以观察到PCR扩增产物电泳分析图谱上的不同等位基因，进而对个体间的遗传关系、多样性、进化历史等问题进行研究。
微卫星多态性分析技术在20世纪80年代初期就开始被应用于分子生物学领域内的遗传分析和种群学研究中。
20世纪90年代以来，读长技术的进步和计算机处理能力的提高，使得微卫星多态性分析技术得以应用于全基因组水平的遗传多样性和基因组进化的研究中。
近年来，随着第二代和第三代测序技术的不断发展，微卫星多态性分析技术的应用也得到了新的拓展。
二、微卫星多态性分析技术的原理和方法微卫星多态性分析技术的原理和方法主要包括：1）PCR扩增和电泳检测；2）全基因组微卫星扫描；3）比对和分析。
1）PCR扩增和电泳检测PCR扩增是微卫星多态性分析技术的核心步骤。
PCR扩增过程中，需要设计合适的引物和PCR反应条件。
PCR产物通过电泳分析，可以将不同等位基因分离出来，从而对个体间遗传关系进行研究。
PCR扩增和电泳检测的方法对于单个微卫星标记的分型具有高度的灵敏性和可靠性。
2）全基因组微卫星扫描随着第二代测序技术的发展和成本的降低，全基因组微卫星扫描技术开始逐渐被应用。
该技术通过对全基因组内微卫星序列的筛选和扩增，得到大量微卫星标记，再利用高通量测序技术进行分型，以便快速得到个体间的遗传关系、多样性和进化历史等信息。
1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。
反应体系为：ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA 2µL总体积20µL酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。
PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。
Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。
3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。
连接反应体系如下：ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。
10h左右。
4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。
扩增引物为A3。
反应体系如下：ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2＋2µLdNTPs（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。
