各类层析色谱分析技术完全讲解

色谱层析色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。

文字在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。

色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

【色谱理论】保留时间的理论保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。

保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：tR = t0(1 + KVs / Vm)式中tR表示某物质的保留时间，t0是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。

K为分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。

这个公式又叫做色谱过程方程，是色谱学最基本的公式之一。

在薄层色谱中没有样品进入和流出固定相的过程，因此人们用比移值标示物质的色谱行为。

比移值是一个与保留时间相对应的概念，它是样品点在色谱过程中移动的距离与流动相前沿移动距离的比值。

与保留时间一样，比移值也由物质在色谱中的分配系数决定：R_f=\frac{V_m+KV_s}其中Rf是比移值，K表示色谱分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。

基于热力学的塔板理论塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。

一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。

根据塔板理论，待分离组分流出色谱柱时的浓度沿时间呈现二项式分布，当色谱柱的塔板数很高的时候，二项式分布趋于正态分布。

则流出曲线上组分浓度与时间的关系可以表示为：C_t=\frac{\sigma\sqrt{2\pi}} e^{-\frac{(t-t_R)^2}{2\sigma^2}} 这一方程称作流出曲线方程，式中Ct为t时刻的组分浓度；C0为组分总浓度，即峰面积；σ为半峰宽，即正态分布的标准差；tR为组分的保留时间。

层析法色谱法层析法和色谱法都是现代化学分离技术的代表，它们广泛应用于生命科学、制药、化工等领域。

层析法是通过将混合物分离成不同的化合物分馏，分别被吸附在固体材料的不同区域，最终通过逐一反向洗脱的方法分离成单一组分。

层析法有多种类型，例如纸层析、薄层层析、气相层析、离子层析和凝胶层析等。

纸层析是一种简单的动态层析技术，特别适用于生物材料的色素和其它天然产物的分离。

薄层层析是一种静态层析方法，采用由超薄硅基板制成的薄（0.1-0.5mm）多孔度的二氧化硅层面。

离子层析和凝胶层析则是两种常见的固相高效液相色谱。

层析法具有处理任务多样、样品迅速处理和分离效率高等优点。

它可以将大量样品快速地分离，并且不需要高温和高压。

同时，它还可以根据需要选择不同类型的层析方式，以得到更好的结果。

例如，凝胶层析可以分离具有不同形状、大小和电荷特性的发酵液蛋白质样品。

色谱法的分离原理是根据组分在固定相和流动相中的分配系数不同，使流动相中的混合物分离成单一组分。

色谱法的主要类型有气相色谱、液相色谱和离子色谱等。

气相色谱是目前应用最广的色谱方法之一，主要用于气态分子分离和分析。

它的分离依据是各种气体和固体、液体之间的化学亲和力、大小排列不同等作用。

液相色谱是利用需要分离的混合物在液相和固定相中存在不同亲和性来实现分离。

液相色谱广泛应用于生物化学、制药、地质、环境保护、食品工业等领域，能够分离各种化合物，包括有机化合物、天然产物，以及大分子类的物质，例如蛋白质和核酸。

离子色谱则是一种能够分离大量离子化合物的稳定色谱，它可以自动地定量分析各种离子化合物，例如常见的硫酸盐和硝酸盐等。

总的来说，层析法和色谱法是现代化学分离技术中最常见且重要的方法之一。

它们在各个领域中发挥着不可替代的作用，我们相信随着科技的发展，这两种方法将更加成熟和广泛应用。

层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作(3)柱层析的基本装置及基本操作目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。

(1)柱层析的基本装置柱层析的基本装置，如图2－21 。

(2)柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤：①装柱柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。

一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。

否则要重新装柱。

首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。

一般柱子的直径与长度比为1:10~50，凝胶柱可以选1:100～200。

然后将柱子洗涤干净。

将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸(0.5～1mol/L)、碱(0.5 ~1mol/L)、盐(0.5~ 1mol/L)溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。

然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起)，以除去其内部的气泡。

关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm 高。

打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液，吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。

注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。

最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。

②平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液 (有一定的pH 和离子强度)平衡柱子。

用恒流泵在恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同。

平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。

如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。

有时柱子平衡好后，还要进行转型处理，这方面的内容将会在离子交换层析中加以介绍。

③加样加样量的多少直接影响分离的效果。

薄层色谱和柱层析一、薄层色谱（TLC）1.原理：薄层色谱是一种基于分子在固体表面和流动相之间相互作用的分离技术。

它使用薄层固定在玻璃或铝板上的吸附剂（例如硅胶或氧化铝）来分离混合物中的化合物。

在色谱板上涂覆样品后，通过液态或气态的流动相让混合物成分在吸附剂上移动，不同化合物的移动速度不同，从而实现分离。

2.应用：薄层色谱被广泛应用于药物化学、食品科学、环境科学和生命科学等领域。

它通常用于混合物的分析，确定混合物中是否存在特定化合物。

此外，它也可用于纯化样品中的化合物，通过可视化或其他检测方法来定位目标化合物位置。

3.操作步骤：薄层色谱的操作步骤主要包括：（1）准备色谱板：将吸附剂均匀涂覆在固定的玻璃或铝板上，使其成为薄层。

（2）样品的涂覆：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，并用微量移液管将样品均匀地涂覆在色谱板上。

（3）开展分离：将涂覆了样品的色谱板悬挂在色谱槽中，加入合适的溶剂溶液，使之满足色谱板的一端。

（4）显色：在色谱板完全干燥后，通过目视或化学法将化合物可视化。

常用的显色剂包括碘、紫外线灯或化学染色剂。

二、柱层析（CC）1.原理：柱层析是一种基于分子在固定填料（固相）和流动相之间相互作用的分离技术。

根据样品的特性选择不同的固相材料，并将其装填在柱中。

当样品通过柱时，不同化合物与固相发生不同程度的相互作用，从而分离。

2.应用：柱层析广泛应用于化学和生物化学领域，用于分离和纯化化合物。

它可用于药物合成中的纯度检查、食品中毒素的分离、蛋白质的纯化等。

柱层析的分离效果通常较好，纯度高。

3.操作步骤：柱层析的操作步骤主要包括：（1）准备填料和柱子：根据需要选择适当的固相材料，并将其装填在柱子中。

（2）样品的预处理：将待分离的样品预处理，如溶解在适当的溶剂中，并清除杂质。

（3）样品注入：将样品注入柱中，注意控制样品体积和注入速度。

（4）洗脱：通过加入不同组成的洗脱液（流动相），使样品中不同化合物以不同速率从柱中洗脱。

层析法的主要介绍及其应用1.层析法的概念层析法又称色谱法[1]．色层法或层离法（Chromatography），是一种应用很广的分离分析方法。

1903年，俄国的植物学家M，C．UBeT在研究分离植物色素过程中，首先创造了色谱法，这是一种根据化合物的不同结构和不同的物理，化学特性，从而具有不同吸附性能的原理，以分离混合物中的化学成分的一种物理化学分离方法，最初用于有色物质，之后应用于大量的无色物质。

色谱法的名称虽然仍然沿用，但已失去原来的含义。

层析法和其他分离方法比较，具有分离效率高，操作又不太麻烦的优点。

因此，层析法的应用越来越广，对于近代化学科学的发展有巨大的影响。

在制药、化工、农业、医学等方面都有着广泛的应用。

2.层析法的历史及原理层析法的历史1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。

1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。

1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。

茨维特被世人公认为色谱创始人。

德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。

Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖.1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。

2.2层析法的原理层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。

层析技术的种类及其基本原理层析技术是一种分离化合物的方法，它是基于物质在不同相中的分布系数不同而实现的。

层析技术主要包括三种类型：薄层层析、柱层析和气相色谱。

一、薄层层析1.1 基本原理薄层层析是一种简单易行的分离方法，它利用了化合物在固定相和移动相之间的分配系数差异进行分离。

通常情况下，我们将待测样品涂在硅胶或氧化铝等吸附剂上，然后将其放置在一个玻璃板上，形成一个薄而均匀的涂层。

接着，我们将这个玻璃板放入一个密闭的槽中，在槽底部加入适量移动相。

当移动相向上升时，它会与样品发生反应并带走它们。

由于不同化合物在固定相和移动相之间具有不同的分配系数，因此它们会以不同速度被带走，并最终被分离出来。

1.2 分类根据吸附剂的不同，薄层层析可以进一步分为硅胶层析、氧化铝层析和纸层析等。

1.3 应用薄层层析广泛应用于食品、化妆品、药品等行业中，用于分离和鉴定其中的成分。

二、柱层析2.1 基本原理柱层析是一种利用固定相和移动相之间的互作用进行分离的方法。

通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加入适量移动相来进行分离。

在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。

2.2 分类根据固定相的不同，柱层析可以进一步分为凝胶柱层析、反相柱层析和离子交换柱层析等。

2.3 应用柱层析广泛应用于生物技术、制药工业以及环境监测等领域中，常用于纯化和提取目标物质。

三、气相色谱3.1 基本原理气相色谱是一种利用气体载流体将混合物分离成单独组分的方法。

通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加热来蒸发样品中的化合物，并将它们带入气相。

接着，我们将气相送入到一台质谱仪中进行分析。

在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。

3.2 分类根据固定相的不同，气相色谱可以进一步分为毛细管气相色谱、开放管气相色谱和微柱气相色谱等。

3.3 应用气相色谱广泛应用于食品、环境、制药等领域中，常用于分析和鉴定其中的成分。

柱色谱、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。

2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。

二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。

色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。

色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。

色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。

2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。

3、鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。

但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。

所以，要获得重现的比移值就比较困难。

为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。

4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。

吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。

吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。

柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。

吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。

分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。

柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。

有机化学基本技能色谱分析与柱层析技术色谱分析与柱层析技术是有机化学中常用的基本实验技能，它们在有机合成、分离纯化以及分析鉴定等领域都有广泛的应用。

本文将介绍有机化学基本技能中的色谱分析与柱层析技术，并探讨它们在有机化学实验中的应用。

一、色谱分析技术色谱分析是一种将混合物中的成分分离并测定其含量的方法。

它基于分析物在固定相（色谱柱）与流动相（溶剂）之间存在差异，通过运动速度上的差异使其分离开来。

常见的色谱分析技术包括薄层色谱、气相色谱和液相色谱等。

1. 薄层色谱薄层色谱是一种将分离物质分离并测定其含量的快速、简便的方法。

它利用薄层具有吸附能力的材料作为固定相，将待分离物涂覆在薄层板上，然后将薄层板悬置于溶剂中，溶剂通过毛细作用上升，将样品中的组分分离开来。

分离完成后，可以通过观察色斑的位置、颜色和荧光等性质来确定各组分的存在和含量。

2. 气相色谱气相色谱是一种将挥发性或温度稳定的化合物分离和测定的方法。

它利用气态载气作为流动相，在柱子上涂覆液态或固态的固定相，通过分析物在固定相上的吸附和解吸过程中的速度差异，实现物质分离。

通过检测来自柱尾的挥发物质，可以得到各组分的峰值图谱，进而确定它们的存在和含量。

3. 液相色谱液相色谱是一种将有机混合物分离和测定的方法。

它利用溶剂作为流动相，将待分离物溶解在流动相中，流经具有吸附性的固定相（色谱柱），通过分析物在固定相上的吸附和洗脱过程中的速度差异，实现物质分离。

通过检测来自柱尾的溶质，可以得到各组分的峰值图谱，进而确定它们的存在和含量。

二、柱层析技术柱层析技术是一种将分离物质从样品中提取并纯化的方法。

它基于不同物质在固定相（填料）中具有不同的亲和力，通过逐渐改变流动相的成分和浓度，使不同的组分先后从柱子上洗脱出来。

常见的柱层析技术包括凝胶层析、分子筛层析和反相层析等。

1. 凝胶层析凝胶层析是一种利用凝胶作为固定相的柱层析技术。

凝胶的孔隙大小可以根据待分离物质的分子大小来选择，通过选择合适的凝胶和流动相条件，在柱子上进行适当的洗脱操作，可以将待分离物质从样品中提取并纯化。

各类层析色谱分析技术完全讲解层析色谱是一种常见的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物化学、环境分析等领域。

根据所用的分离相和分离原理的不同，可以分为多种不同的层析色谱技术。

下面将分别介绍几种常见的层析色谱分析技术。

1. 气相色谱（Gas chromatography，GC）气相色谱是利用气体载气将样品中的挥发性化合物分离的技术。

它主要包括进样、分离柱和检测器三个部分。

进样时，样品被蒸发进入气相柱，然后在柱中与载气混合并分离。

最后利用不同的检测器对分离后的化合物进行检测和定量。

2. 液相色谱（Liquid chromatography，LC）液相色谱是利用液体溶剂将样品中的化合物分离的技术。

根据不同的液相分离机制，液相色谱可以分为几种类型，如反相色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱等。

液相色谱通常由进样系统、柱和检测器组成，其中柱是最重要的部分，不同的柱可以用来实现不同的分离目标。

3. 离子色谱（Ion chromatography，IC）离子色谱是专门用于分离和分析离子化合物的技术。

它使用离子交换柱和离子交换树脂，通过控制流动相的pH值和离子浓度来实现不同离子的分离。

离子色谱广泛应用于水质分析、环境监测和生物分析等领域。

4. 薄层色谱（Thin layer chromatography，TLC）薄层色谱是一种简单且快速的分离技术，它使用特殊涂层的玻璃、金属或塑料薄片作为固定相。

样品溶液通过毛细作用或被吸附和分离在固定相上，然后可以使用不同的显色剂或检测器进行可视或仪器定量分析。

以上是其中几种常见的层析色谱分析技术，每种技术都有自己的特点和应用领域。

层析色谱技术的应用范围广泛，可以用于分离和检测不同类型的化合物，从而为科学研究和实验室分析提供了有力的工具。

层析技术讲义层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。

他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。

当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。

随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。

为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。

他们首先提出了色谱塔板理论。

这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。

其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。

特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。

前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。

因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。

如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。

但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。

现在我们简称为层析法或层析技术。

层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。

而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。

因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。