下载文档原格式
生物酶型有机解堵剂生物酶型有机解堵剂是以天然有机化合物和微生物培养物为主要原材料，经过特殊发酵和提取工艺加工而成的。
该产品具有多种酶活性，能够利用生物酶的特殊催化作用，针对石油井脏堵问题展开对策，对于井下沉积物、聚合物、脂肪酸盐等各种形式的沉淀都具有一定的溶解能力，可以快速有效地消除产生井脏堵的原因。
本文将从以下几个方面介绍生物酶型有机解堵剂的性能、应用和进展。
一、解堵机理生物酶型有机解堵剂的核心成分是各类酶，包括蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶等。
这些酶活性高、催化效果好、作用范围广，能够将各种沉积物进行分解与溶解，使井底的堵塞物质得以顺利通畅地流出。
其中，淀粉酶是一种极具生物活力的成分，能够分解出大量的葡萄糖分子，营养丰富，又能够作为其他微生物的营养源，因此淀粉酶的加入不仅可以增强生物酶型有机解堵剂的解堵效果，还能够促进微生物的生长繁殖，形成一种良性循环，从而加速沉积物的降解过程。
二、性能特点1、对井脏堵问题具有快速有效的解决能力，能够在短时间内恢复井下产能，提高油气采收率；2、产品成分天然、安全环保，不会造成地下水、土壤等污染问题；3、生物酶型有机解堵剂具有良好的渗透性和分散性，能够迅速渗透到井壁及周围的地层中，发挥解堵作用，不易残留、不引起二次污染；4、生物酶型有机解堵剂由于是利用微生物的催化作用进行解堵，因此比传统的物理化学方法更加温和，可以有效减少地层损伤和井筒管柱腐蚀的问题。
三、应用范围生物酶型有机解堵剂主要适用于各类油气井（包括注水井、采油井、提气井、气藏注氮井等）井底的沉淀物、聚合物等造成的堵塞问题。
与传统的化学解堵方法相比，生物酶型有机解堵剂除了具有更加理想的解堵效果外，还能够在减弱地层损伤、缩短解堵时间、降低井下接头阻力等方面都具有优越性。
四、发展前景由于生物酶型有机解堵剂具有优越的性能和广泛的应用前景，目前国内外都在不断加强相关技术的研究和开发。
与此同时，随着环保意识的逐渐提高，生物酶型有机解堵剂将会得到更加广泛的推广和应用，成为化解井堵难题的重要手段之一。
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
产蛋白酶菌种的分离与纯化--初筛一、目的要求1 学习蛋白酶产生菌的筛选方法。
2 掌握稀释涂布平板法从自然环境中分离纯化微生物的基本操作技术。
3 进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
二、基本原理土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。
工业微生物菌种最初都来自于自然界。
但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得工业发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：简单单细胞挑取法和平板分离法。
本实验用平板分离法。
平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂平板法或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定保证是纯培养。
因此纯培养的确定要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
蛋白酶是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。
根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。
产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。
三、实验器材与试剂1 样品土壤样品。
2 培养基酪素培养基配方如下：葡萄糖0.5gNaCl 5gK2HPO4 0.5gKH2PO4 0.5g干酪素10g蒸馏水1000ml琼脂20gpH 7.5115℃灭菌30min。
生物酶解堵技术简介生物酶解堵技术是近几年发展起来的一项新技术，使油田化学新技术在油田应用上的一项技术革命，特别是近两年来该技术发展之快速，是其它化学技术的发展不可比拟的，生物酶技术在油田上的应用是油田化学技术上的一项技术革命，由于该技术的发展，解决了油田生产中很多难以解决的复杂问题，如生物酶解堵剂，生物酶污水处理药剂，生物酶分子膜制剂，生物酶清防蜡和降粘的研究，生物酶降解技术，生物酶驱油增产技术等等。
特别是在油田化学解堵方面取得了较的成绩，在全国油田范围的成功拓展和应用已经涉及到海洋油田、陆上稠油、低渗透和特低渗透油田、高含蜡油田、三次采油等领域。
一、生物酶解堵剂作用机理生物酶解堵剂是一种新型、高效的生物酶高科技制剂，其主要成份是多种天然提取物质，其技术完全根据油田开发中出现的油水井生产层系堵塞、产能降低等问题而设计开发的。
产品根据不同区块油藏构造条件进行调整从而形成了一套完整的系列。
其解堵技术思想具有前瞻性和革命性，提供了解决油层堵塞、油井生产期短的难题的技术方案。
另外，作为绿色环保型有机化学品，生物酶产品具有良好的安全、稳定、环保特征，符合油田开采中HSE工作环境的要求。
1、利用生物酶及其活性物质的激活催化作用，促进化学反应快速进行，多种活性物质快速将油垢从堵塞处剥离、降解稀释；2、剥落和解除堵塞的垢质经降解、降粘稀释后同其它分散油快速聚并，形成稀释油墙，油流带；其中包括将乳化的死油和中断的死油诱导聚并形成连续的稀软油流带，通过孔喉；3、残存的活化物质形成一定厚度分子膜，具有改善、稳定岩层、使地层成为水润湿地层，阻止垢再次沉积和诱导油流作用，增加反应期；二、生物酶制剂的应用:1、解除因稠油积垢造成的油井堵塞，不能正常开采的问题；2、解除有机物胶质沥青对地层的堵塞而需洗井、作业的油水井；3、含蜡油井的清洁及预防处理；4、由于残存油等伤害对水井造成的注水低效问题；5、酸化，防砂工艺的前置液；6、油井因作业伤害造成的产量降低问题，7、三次采油增产三、解堵剂的特点1、PH值为7，属中性，对油田管道和井下设备没有腐蚀；2、环保性能好，符合油田企业HSE标准要求，对石油生产环境无污染，对人畜无伤害，；3、具有良好的活性和催化力，激活剥离碳氢化合物能力显著；4、对地层岩芯具有良好的恢复、稳定功能, 有明显的油藏保护特征；5、水溶性产品，润湿效果好，能加快水分子运动；6、具有良好的预防垢质再次沉积功能；7、特别是与复合解堵剂同时应用效果更佳；即解决了有机垢质对井眼井筒堵塞又解决了无机垢和地层黏土颗粒堵塞。
产蛋白酶乳酸菌的筛选筛选生产蛋白酶乳酸菌的开题报告摘要乳酸菌的蛋白酶在从食品技术、纤维素加工、植物细胞壁改良以及其他工业应用中，都具有重要的应用价值。
本研究的目标是筛选出具有优异生产蛋白酶乳酸菌的分离株。
为此，首先对研究区域的乳酸菌进行分离，并用试管发酵法定量观测多个培养基的发酵活性，选择出最有潜力的分离株；其次，运用多因子正交实验确定最佳发酵培养基和条件；最后，用相应培养基和优化的发酵条件，采用比色法测定蛋白酶活力，并对多个分离株比较，以筛选出具有优异生产蛋白酶活力的乳酸菌。
本课题借助多种技术和方法，结合系统严密的科学实验，探索以生产蛋白酶为特征的乳酸菌分离株的最佳条件，实现蛋白酶高效分离的目标，对乳酸菌育种具有重要意义。
关键词：乳酸菌；蛋白酶；发酵；正交实验IntroductionLactic acid bacteria are widely present in nature, including soil, vegetables, fruits and food. They are Gram-positive, non-spore-forming, and anaerobic or facultative anaerobic in nature. Lactic acid bacteria have strong acid and bile resistance, and can be used as probiotics and therapeutic agents.In order to isolate and select lactic acid bacteria with excellent proteinase production capabilities, this paper proposes to select lactic acid bacteria with excellentproteinase production capabilities by the following steps. Firstly, the lactic acid bacteria in the research area will be isolated, and the fermentation activity of multiple culture media will be quantitatively observed by tube fermentation method, and the most promising strains will be selected. Secondly, the optimal fermentation culture medium and conditions will be determined using multi-factor orthogonal experiment. Finally, the proteinase activity will be determined by colorimetric method with the corresponding culture medium。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
生物酶解堵剂在胜利油田的应用1. 前言介绍生物酶解堵剂的概念、背景和意义。
2. 生物酶解堵剂的成分和作用机理详细介绍生物酶解堵剂的成分、作用机理和形态结构等方面的知识。
3. 生物酶解堵剂在胜利油田的应用着重阐述生物酶解堵剂在胜利油田应用的具体情况，包括应用的原因、使用的方法和结果等方面的内容。
4. 应用效果分析对生物酶解堵剂在胜利油田的应用效果进行分析，探讨生物酶解堵剂在解决油井堵塞等问题中的优势和局限性。
5. 结论与展望总结本文所介绍的生物酶解堵剂在胜利油田中的应用情况、应用效果分析和对于其未来发展的展望，为相关研究提供参考。
1. 前言石油资源是国家经济活力的重要支撑，而油井的堵塞却经常对油田开发产生问题。
油井的堵塞一般是由于油井地层中的沉积物、胶体物质、化学物质和微生物等因素叠加而导致的。
然而，传统的清洗方法因为对油井的管壁、地层等形成环境产生损害，使得油井的修复变得困难。
因此，越来越多的研究者开始寻找新的油井堵塞清洗方法，而其中一种备受关注的方法就是生物酶解堵剂。
生物酶解堵剂是一种新型的清洗、养护和驱油杀菌剂，它源于自然界中存在的酶类生物体。
它通过添加一定的酶类微生物，对于油井管壁、地层中的杂质进行酶解分解，以达到清洗、养护的效果，并且可以在不对环境产生危害的情况下达到驱油杀菌的目的。
没有清洗干净的油井会对油井的产量和生产效率产生影响，严重的甚至会导致油井的停产。
生物酶解堵剂能够充分发挥自身的清洗效果，有效地悬浮分散和分解油井中种种覆盖物，防止其再淤积，以确保油井通畅，生产效益高。
此外，生物酶解堵剂还具有环保、安全、节约、经济等特点。
生物酶解堵剂在酶类微生物的作用下分解，不会对环境产生污染，并且具有很好的生物降解性，也不会对装置等产生腐蚀性损害，因此在应用中也得到了广泛的关注和推广。
综上所述，生物酶解堵剂是非常有应用价值的一种新型格局。
在胜利油田的应用中，不仅可以帮助解决油井的淤塞问题，保证油田的正常运行，同时还可以为环境保护和经济发展做出贡献。
一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法可以采用以下步骤：
1. 采集不同环境样品，如土壤、水体、植物等，制备样品悬浮液。
2. 将样品悬浮液分别接种到含有蛋白质的琼脂平板上，培养24-48小时。
3. 观察菌落形态和周围透明圈的大小，筛选出产生蛋白酶的菌株。
4. 对筛选出的菌株进行初步鉴定，如形态学观察、生理生化特性检测等。
5. 通过测定菌株在不同培养条件下的蛋白酶产量，筛选出高产蛋白酶的菌株。
6. 对高产蛋白酶的菌株进行进一步鉴定和优化培养条件，以提高蛋白酶产量和质量。
该方法简单易行，可快速筛选出高产蛋白酶霉菌菌株，适用于大规模筛选和优化培养条件。
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【摘要】以酪蛋白水解圈为筛选标记，在以酪蛋白为唯一氮源的平板上，从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株，经形态学鉴定和16S rRNA分析，将其分别鉴定为Bacillus sp．G1、Bacillus sp．G2、Stenotrophomonas sp．V1。
将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后，其比酶活分别为22．21、19．10和16．03 U／mg。
菌株Bacillus sp．G1和Ba-cillus sp．G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7．0；菌株Stenotrophomonas sp．V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃，最适酶反应pH值为7．5。
%Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1.Bacill us sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were all aerobic strains.The proteases from Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively.The enzymes from Bacillus sp.G1 and G2 were optimally active at 40℃and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer( PBS, pH 7.0) , and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp.V1 was optimally active at 70℃and in 20 mmol/L PBS buffer ( pH 7.5) .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)004【总页数】7页(P32-38)【关键词】蛋白酶;筛选;鉴定;酶学特性;Bacillus sp.G1;Bacillussp.G2;Stenotrophomonas sp.V1【作者】赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045【正文语种】中文【中图分类】TQ925.2蛋白酶(Protease, EC 3.4)属于水解酶类,是最重要的三大工业用酶之一,销售额约占全球酶制剂市场的60%[1],被广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业,在我国国民经济的发展中起着重要的作用[2]。
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。
方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。
2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。
2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。
2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。
3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。
2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。
5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。
2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。
发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。
2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。
3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。
4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。
5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。
结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。
2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。
3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。
4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。
文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
高效石油降解菌株的筛选及菌群的构建徐志霞;张颖;金显敏;梁晨;李丹;金映虹【摘要】从海南澄迈油井周围污染的土壤中采集样品，以原油为唯一碳源，经初筛、复筛得到13株具降解石油性能的微生物，其中J-2、J-4、J-12、J-13菌株在培养10 d后，其石油降解率分别可达到27.92％、37.36％、30.98％和14.10％.选择这4株菌进行2株菌、3株菌、4株菌的混合培养，构建了11个降解石油的微生物体系，研究发现J-2与J-4混合菌群降解效果最好，高达71.58％，明显优于其他的混合菌群体系和单菌株的降解效果.根据形态学观察和生理生化特征对这4种菌株进行鉴定，初步确定为粉红头孢霉属（Cephaesosp），青霉属（Penicillium），链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas）.%Four strains of high efficient oil degrading which could take used of petroleum as sole carbon source were isolat⁃ed from Hainan Chengmai, and marked as No. J-2, J-4, J-12 and J-13. After incubation for ten days, every strain’s degra⁃dation rate of petroleum was 27.92%,37.36%, 30.98%, and 14.10%respectively. In the further exploration of mixed cul⁃ture of two bacteria, three bacteria or four bacteria, 11 microbial systems of degradation petroleum had been built. The re⁃sults showedthat the degradation rate of system No. J-2 and J-4 could reach 71.58%, which had the most efficient degrad⁃ing than any other systems or single strains in this study. These strains were preliminary identified as Cephaesosp, Penicilli⁃um, Streptomyces and Xanthomonas by physiology and biochemistry research.【期刊名称】《海南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P421-424)【关键词】石油;高效降解;筛选;菌群构建【作者】徐志霞;张颖;金显敏;梁晨;李丹;金映虹【作者单位】海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158【正文语种】中文【中图分类】Q939.9石油是含有各种芳香烃、烷烃、环烷烃成分的一种复杂混合物，是古代海洋或湖泊的生物经过漫长的演化而形成的一种化石燃料［1-2］.目前，石油及其提炼品（汽油、煤油、柴油等）在人类生产和生活中扮演着极其重要的角色，因此被人们称为“工业血液”［3］.当今能够替代石油的新型能源由于成本高等原因尚未能广泛应用，因此人们对石油的需求量仍然居高不下［4］.然而石油在开采、运输、装卸、加工和使用过程中，对环境造成严重污染，产生致癌物，污染土壤、地下水源、海洋环境等，危害人类健康.传统的石油污染治理方法主要为物理和化学方法，但其治理效果不佳，耗资巨大，并残余大量有毒物质于自然环境中，因此微生物修复技术（Bioremediation）以其经济、安全、效率高、适用范围广和无明显的二次污染等显著优点［5］越来越引起人们的关注.大多数未污染土壤的复杂微生物群落都含有天然降解石油的微生物，这种固有的特性使大多数土壤具有很大的石油降解能力［6］.大量的研究表明，在生物圈中，可以降解石油污染物的微生物超过100余属，200多个种，分属于霉菌、酵母菌、细菌、放线菌等［7］，其降解菌种类十分丰富，具有菌种的多样性.但是石油组成成分复杂，很难实现只靠一种微生物即可对其污染物实现完全降解.本研究通过对石油污染土壤样品进行筛选，得到4株高效石油降解菌株，根据形态学观察和生理生化特征初步鉴定为粉红头孢霉属（Cephaesosp）、青霉属（Penicillium）、链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas），并以此为基础进行石油降解微生物菌群的构建及研究，进一步提高降解效率，达到更高效降解石油的目的.1.1 材料1.1.1 实验材料原油及土样均采自海南澄迈油井.1.1.2 培养基原油培养基：NH4NO31.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.02g，Na2EDTA·2H2O 0.02g，FeCl30.05g，蒸馏水1000 mL，pH7.4，分装时每50 mL培养基加1 mL原油.固体平板培养需另外加入2%琼脂. 1.2 方法1.2.1 石油降解菌的富集培养和分离纯化［8］将5 g（干重）石油污染土壤接入45 mL原油培养基中，30℃，180 r/min恒温摇床上富集培养7 d.取培养液在原油平板培养基上进行划线分离，同时取适量菌液进行稀释，在原油平板培养基上涂布分离，将培养皿置于30℃培养箱中进行培养，定期观察.另外，将富集培养液按10%的比例接入新鲜的原油培养基中，相同条件下进行第二次富集培养，同样操作进行3次，每次的富集培养液都经过划线和平板稀释分离.3次富集培养之后，观察平板上长势良好的优势菌株，选取形态特征一致的单菌落，并分别接种于相应的牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏Ⅰ号培养基、马铃薯培养基中，进行多次划线分离，纯化得到单菌后斜面保存.1.2.2 高效石油降解菌的筛选将分离纯化得到的具有降解石油能力的13株菌株，分别接种至含50 mL原油培养基的三角瓶中，接种量为1 mL，以不接种的原油培养基作空白对照组，30℃，180 r/min振荡培养10d.培养结束后采用重量法测定每株菌的石油降解率［9］.降解率=（m3-m2）/m1×100%m3为对照组的残余油量，m2为降解后的残余油量，m1为最初的含油量.1.2.3 高效石油降解体系的构建通过筛选得到4株高效石油降解菌，分别接种至含50 mL原油培养基的三角瓶中，30℃，180 r/min振荡培养24 h，制备一定浓度的菌悬液，接种于装用原油培养基的三角瓶（装液量50 mL/250 mL）中，每株菌接种量均为1 mL，30℃，180 r/min振荡培养10d.培养结束后测定每个微生物降解体系的降解率，选出较佳的降解体系.1.2.4 高效石油降解菌的初步鉴定根据菌株的形态特征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手册［10］、常见细菌系统鉴定手册［11］、常见真菌鉴定手册［12］，对分离得到的石油降解菌进行初步鉴定.2.1 石油降解菌的富集培养和分离纯化从海南省澄迈采集的石油污染土样通过原油培养基的3次富集培养后，挑选生长良好的优势菌株，分离纯化得到具有较好石油降解能力的细菌8株，霉菌4株及放线菌1株，共计13株菌株.2.2 高效石油降解菌的筛选将富集分离纯化得到的13株菌株，并分别接种于原油培养基中培养，与未接菌的空白对照组进行对比，观察培养液的颜色、混浊程度及分层现象等变化.培养前，培养液上下层呈黑褐色和乳黄色.培养后，培养液出现三种情况：图1-A，培养液分为3层，由上往下依次为残余石油油膜、褐色絮状物和浅褐色溶液；图1-B，培养液颜色澄清透明，分散着明显的真菌丝状菌落，菌体中间呈深褐色；图1-C，培养液无明显变化.进一步对13株菌进行石油降解率的测定（见表1），其中J-2、J-4、J-12、J-13编号的菌株降解率较高，分别为27.92%、37.36%、30.98%、14.10%，挑选这4株菌株用以构建降解菌群.2.3 石油降解菌的菌群构建将筛选获得的具有高效降解石油性能的菌株J-2、J-4、J-12、J-13进行不同的组合，分别2株菌、3株菌和4株菌混合，等比例接种培养，构建不同的微生物降解菌群，并检测其石油降解率，通过与单菌株的降解率比对，研究不同降解体系的降解效果（见表2）.根据表2的降解率可初步判断，不同菌株构成的降解菌群相对于单菌株而言，降解率有的升高，有的降低，这可能是由于不同菌株之间的相互作用导致的.其中由菌株J-2和J-4的混合降解组降解效果较其他组高，在装液量50 mL、石油浓度为2%的培养基中，10 d后其石油降解率可达到71.58%，较单菌株中降解效果最好的J-4的降解率提高近一倍.2.4 高效石油降解菌的初步鉴定对J-2、J-4、J-12、J-13进行鉴定，其菌落形态特征见表3，菌体形态见图2，可初步判断J-2、J-4为真菌，J-12为放线菌，J-13为细菌.其中，J-13的染色结果表明该菌为革兰氏阴性细菌.对J-12和J-13进行了生理生化特征试验，其结果见表4.根据上述实验结果，参照参照伯杰氏细菌鉴定手册［10］、常见细菌系统鉴定手册［11］、常见真菌鉴定手册［12］，初步鉴定J-2为粉红头孢霉属（Cephaesosp），J-4为青霉属（Penicillium），J-12为链霉菌属（Strepto⁃myces），J-13为黄单胞菌属（Xanthomonas）.随着国内外经济的发展，随着原油的开采量不断上升，由此引起的土壤及海洋石油污染日益加剧. 20世纪80年代末，美国在短时间内利用生物修复技术成功清除了油轮石油泄漏的污染物，开启了生物修复技术的研究，也引发石油污染微生物降解的讨论［13］.在本研究中以海南澄迈油井附近被石油污染的土壤为样品，利用石油为唯一碳源的培养基富集纯化得到的13株菌，经过筛选获取降解效果较好的4株菌，分别为J-2、J-4、J-12、J-13，在装液量50 mL、石油浓度为2%的培养基中，10d后其石油降解率可达到27.92%、37.36%、30.98%、14.10%.由于石油成分复杂，依靠单一的微生物无法彻底完成石油的降解，需要通过具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能实现石油污染物的完全降解［14］.本研究对筛选得到的4株菌进行2株菌、3株菌、4株菌混合培养，构建了11个降解石油的微生物体系，通过与单菌株降解率比较，发现J-2与J-4混合菌群降解效果最好，可将降解率提高至71.58%，明显优于其他的微生物体系的降解效果.根据形态学观察和生理生化特征对这4种菌株进行鉴定，初步确定为粉红头孢霉属（Cephaesosp），青霉属（Penicillium），链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas）.本研究组将进一步研究培养温度、pH、盐度、时间等对菌株降解能力的影响，通过改变不同菌株在微生物系统中的比例构成，使微生物降解系统达到更好的降解效果.【相关文献】［1］张光宇.SBR工艺污水处理厂抗石油污染物冲击强化处理技术研究［D］.山东：青岛理工大学，2010.［2］陆昕.产表面活性剂石油降解菌的选育及对陕北石油污染土壤生物修复的试验研究［D］.陕西：西北大学，2010.［3］林标声，陈雪英，江胜滔，等.土壤中高效石油降解菌的筛选及其降解特征的研究［J］.福建师范大学福清分校学报，2010，98（2）：11-16.［4］张磊.中国石油安全分析与对策研究［D］.天津：天津大学，2007.［5］邵宗泽，许晔，马迎飞，等.2株海洋石油降解细菌的降解能力［J］.环境科学，2004，25（5）：133-137.［6］阮志勇.石油降解菌株的筛选、鉴定及其石油降解特性的初步研究［D］.北京：中国农业科学院，2006.［7］贾燕，伊华.石油降解菌株的筛选、初步鉴定及其特性研究［J］.暨南大学学报，2007，28（3）：296-301.［8］李超敏，王加宁，邱维忠，等.高效石油降解菌的分离鉴定及降解能力的研究［J］.生物技术，2007，17（4）：80-82.［9］张鹏.石油降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究［D］.山东：山东师范大学，2006.［10］R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰.细菌鉴定手册（第八版）［M］.北京：科学出版社，1984：1037-1161.［11］东秀珠，蔡妙莫.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：128-180. ［12］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科技出版社，1979：132-135；491-495.［13］刘晓春，阎光绪，郭绍辉，等.微生物降解土壤中石油污染物的研究进展［J］.污染防治技术，2007，20（6）：51-54.［14］李宝明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建［J］.中国土壤与肥料，2007（3）：68-72.。
