东方百合品种_西伯利亚_切花生产中替代泥炭的基质研究

山地繁育东方百合种球栽培技术近年来，我国百合的切花生产和消费均增长迅猛，然而种球仍几乎依赖进口，种球自给成为扼制我国百合切花生产的“瓶颈”，实现百合优质商品种球的国产化已势在必行。

浙江省地貌类型多，利用海拔高度不同的温度差对球根花卉的种球膨大发育、花芽分化均十分有利。

选择浙江省的山地冷凉地栽培，对百合进行提纯复壮和籽球繁育，解决我国长期以来百合种球不能自给难题，对于百合切花产业的发展具有深远的意义。

1、东方百合山地繁育栽培技术1．1品种市场畅销的东方百合主栽品种，主要有西伯利亚(Siberia)、索蚌(Sorbonne)、马可(Marcopolo)、元帅(Acapulco)、泰伯(Tiber)，选用周径为6-9厘米规格的籽球进行繁育。

百合籽球可采用直接进口和自繁。

由于近年来荷兰限制出口籽球，采用覆膜地插和全基质控温控湿技术进行规模化的鳞片扦插，获得了大量优质的东方百合籽球。

为促发新根和籽球消毒，种前采用杀菌剂与激素混合液浸种。

1．2地块选择与准备为保证百合植株安全越夏，并使全年的生育期最长，需选择海拔在800―1000米的山地条件。

百合忌连作，对土壤盐分很敏感，故必须选新地种植。

种植前深翻30厘米，畦高至少25厘米，畦宽约1．1米，通路50―60厘米。

种植前土壤应充分疏松，含水量应为60％左右。

百合喜有机肥，每亩应放入充分腐熟的堆肥、牛粪等有机肥2000―3000公斤，为促使籽球迅速发展，增施骨粉、钙镁磷肥、过磷酸钙等含磷钾肥，百合所需的氮、磷、钾比例应为5：10：10。

1．3山地种植参数百合籽球可在春季2―4月定植，也可在9―11月进行秋植，但最忌在春末气温升高后移栽种植，否则成活率降低。

在籽球供应条件许可的情况下，宜在秋季下种。

2003年在缙云县大洋镇山地的定植时间自4月15日至4月28日；2004年在遂昌县高坪乡山地的定植时间分别为自3月20日至4月12日。

百合的种植密度随品种和种球大小等而不同。

外源水杨酸对东方百合夏季生长的影响摘要：以东方百合（Oriental hybrids）杂种系西伯利亚（Siberi）为材料，研究外源水杨酸对东方百合夏季生长的影响。

采用25、50、100、200 mg/L的水杨酸（SA）对西伯利亚进行叶面喷施处理，测定其可溶性蛋白质和叶绿素含量、SOD和POD 活性的变化。

现蕾后分别统计西伯利亚株高、茎粗和花蕾数。

结果表明，与对照相比，西伯利亚叶片中叶绿素、可溶性蛋白质含量上升，SOD和POD（除25 mg/L 处理外）的活性增加。

在0～100 mg/L范围内随着水杨酸浓度的增加，西伯利亚株高、茎粗和花蕾数不断增加，其中以100 mg/L的效果最明显。

说明水杨酸可以提高西伯利亚的耐热性，从而提高夏季切花品质。

关键词：东方百合（Oriental hybrids）；水杨酸；切花品质；耐热性Effects of Exogenous Salicylic Acid on Growth of Oriental Lily in SummerAbstract：Effects of exogenous salicylic acid on the growth of Oritental lily“Siebria” in summer were studied. By spraying 25，50，100，200 mg/L Salicylic Acid（SA），respectively，the content of chlorophyll and soluble protein and the activity of SOD and POD were determined. The plant height，stem diameter and flower bud number were calculated respectively after flower bud differentiation. The results showed that the content of chlorophyll and soluble protein and the activity of SOD and POD was （except the treatment of 25 mg/L）increased by SA treatment. With the increase of salicylic acid concentration in the range of 0～100 mg/L，the plant height，stem diameter and buds number increased，among which the effect of 100 mg/L of SA was the most obvious. These indicated that the thermotolerance of lily cut flower could be improved by SA，thereby enhancing the quality of cut flowers in summer.Key words：Oriental lily；salicylic acid；cut flower quality；thermotolerance百合（Lilium spp.）是单子叶植物亚纲百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物的总称，经过长期选育，目前用于切花生产的主要有东方百合、亚洲百合、麝香百合等类型。

栽培基质和肥料对百合生长的影响作者：邵小斌,等来源：《安徽农业科学》2018年第36期摘要 ;{目的]研究栽培基质和肥料对百合生长的影响。

{方法]以自繁的OT系列百合‘木门’为试验材料，研究基质、肥料二因素对百合株高、茎秆直径、叶绿素含量、茎秆强度的影响。

{结果]国产泥炭土与N、P、K三元复合肥（N∶P∶K=10∶30∶20）组合促进百合长高，达68.64cm;叶绿素含量SPAD值最高，达78.20;国产泥炭土与尿素组合有利于提高百合的茎秆直径，达10.34cm;泥炭土与含微量元素的全价水溶肥（20-10-20+TE）组合显著增加了百合的茎秆强度，达43.92。

{结论]国产泥炭土与含微量元素的全价水溶肥组合综合效果较好，有利于提高百合主要性状。

关键词 ;;基质;肥料;百合;生长中图分类号S;;682.2+65文献标识码A文章编号0517-6611（2018）36-0131-03百合（Liliumspp.）为百合科百合属球根花卉，其花型优美，寓意美好{1]，是世界著名鲜切花，消费量逐年攀升{2]。

在我国，切花百合主要有三大产区，分别为云南昆明、江苏连云港和辽宁凌源等，3地栽培总量占我国的50%以上。

连云港地区每年种植量为1100万粒以上，是主栽鲜切花品种之一。

东方百合对土壤的要求很高，需选择肥沃、土层深厚、结构疏松、富含有机质、排水性好、低盐分的砂壤土{3]。

一般通过对土壤进行改良来达到东方百合对土壤的要求{4]。

连云港地区大多土质黏重、透气性差、pH及盐分含量较高，不利于百合的生长。

为了引导农民采用基质栽培，摒弃传统的土壤栽培模式，同时选择适宜的肥料，提高百合切花质量，笔者开展了基质、肥料综合应用技术研究{5]。

1材料与方法1.1试验材料以自繁的OT系列百合‘木门’为试验材料。

1.2试验设计试验设2个因子：不同基质（S）和不同肥料（F）。

S因子设4种基质，F因子设3种肥料。

2017年9月上旬种植于口径19cm的双色塑料盆中。

核酸酶基因LoENDONUCLEASE1在东方百合花朵衰老过程中的功能分析李蕊蕊;刘玉杰;许鑫彤;刘熠;何颖姣;王彩云;罗靖【期刊名称】《华中农业大学学报》【年(卷),期】2024(43)1【摘要】为明确百合(Lilium spp.)花朵衰老发生的分子机制,在东方百合‘西伯利亚’(Lilium oriental hybrid‘Siberia’)花被片中克隆了一个衰老相关基因LoENDONUCLEASE 1(SAG10),利用qRT-PCR进行基因表达分析,并通过农杆菌介导的拟南芥稳定表达系统和百合花被片瞬时表达体系验证LoENDONUCLEASE 1基因功能。

结果显示,LoENDONUCLEASE 1基因开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸;LoENDONU⁃CLEASE 1在百合花朵和叶片的衰老过程中特异表达,且受到脱落酸和水杨酸的诱导;拟南芥过表达LoENDO⁃NUCLEASE 1株系中叶片叶绿素含量显著低于对照株系,百合花被片中瞬时过表达LoENDONUCLEASE 1基因加速了百合花被片的衰老,且过表达花被片中丙二醛和离子渗透率含量显著高于对照。

结果表明,LoEN⁃DONUCLEASE 1具有促进花朵和叶片衰老的功能。

【总页数】9页(P157-165)【作者】李蕊蕊;刘玉杰;许鑫彤;刘熠;何颖姣;王彩云;罗靖【作者单位】果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室/华中农业大学园艺林学学院【正文语种】中文【中图分类】S682.2【相关文献】1.小麦类核糖核酸酶基因(WRN1)cDNA在自然衰老和黑暗诱导衰老条件下的表达(英文)2.亚精胺对小麦离体叶片衰老过程中核酸和核酸酶的影响3.拟南芥核酸酶基因AtCaN2克隆及功能分析4.亚精胺对小麦离体叶片衰老过程中叶绿素、核酸和核酸酶的影响5.欧芹叶片衰老过程中的核糖核酸酶类型与活性变化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

西北农业学报 2022,31(8):981-989A c t aA gr i c u l t u r a eB o r e a l i -o c c i d e n t a l i sS i n i c a 网络出版日期:2022-04-08 d o i :10.7606/j.i s s n .1004-1389.2022.08.005网络出版地址:h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /61.1220.S .20220407.1656.002.h t m l 百合花香合成相关基因L i M C S 的克隆、定位和表达特性研究收稿日期:2021-08-20 修回日期:2021-10-15基金项目:国家重点研发计划(2018Y F D 1000400);国家自然科学基金(31201645);北京市自然科学基金(6172006)㊂第一作者:张 茜,女,硕士研究生,研究方向为百合花香分子调节机制㊂E -m a i l :z h a n gx i 0522@126.c o m 通信作者:胡增辉,男,教授,研究方向为植物生理生态㊂E -m a i l :b u a h u z e n gh u i @163.c o m 张 茜1,2,罗景琳2,王浩楠1,2,李迎迎1,2,冷平生1,2,胡增辉1,2(1.北京林木分子设计育种高精尖创新中心,北京 102206;2.北京农学院园林学院,北京 102206)摘 要 百合花香中含有大量的萜类化合物,2-C -甲基-D -赤藻糖醇-2,4-环二磷酸合成酶(M C S )是合成单萜的甲基赤藓糖醇磷酸(M E P )途径中的关键酶之一㊂为了进一步探究M C S 在百合花香合成中的作用,克隆了 西伯利亚 百合L i M C S 基因,进行生物信息学分析,使用亚细胞定位确定该基因编码蛋白的位置,根据荧光定量P C R 确定了该基因的时空表达模式㊂结果表明,L i M C S 基因开放阅读框为669b p,编码222个氨基酸,与盾叶薯蓣的相似度最高㊂L i M C S 蛋白定位于烟草叶表皮细胞的叶绿体中㊂L i M C S 基因在 西伯利亚 百合花的半开期表达量最高,花蕾期最低;在盛开期,该基因在花瓣中表达量最高,在其他部位表达量较低㊂结果证明L i M C S 可能参与百合花香单萜类物质合成,这为后续利用基因工程手段调控百合花香释放奠定了理论基础㊂关键词 西伯利亚 百合;L i M C S ;基因克隆;表达分析中图分类号 S 682 文献标志码 A 文章编号 1004-1389(2022)08-0981-09释放花香是开花植物的重要特性㊂花香不仅在促进植物传粉和抵御外来侵害[1-2]等方面发挥着重要作用,而且作为植物重要的观赏性状之一,是评价植物观赏价值和经济价值的重要指标㊂花香由一系列低分子量次生代谢挥发物组成,主要包括萜烯类㊁脂肪族类㊁苯环类/苯丙烷类及一些含硫㊁含氮类等化合物[3-4]㊂深入了解花香合成调控机制能为开展植物花香育种及揭示花香生理生态功能提供理论支撑㊂百合是世界著名的五大切花之一,因其气味芳香浓郁而具有极高的观赏和经济价值㊂百合花香的主要成分为萜烯类化合物,包括芳樟醇㊁罗勒烯和月桂烯等[5-6]㊂笔者的前期研究发现,不同品系百合的花香也存在明显差别[7],如浓香型的东方百合香气过于浓郁,而淡香型的亚洲百合的香味很弱,因此培育芳香适宜的百合新品种成为新的育种趋势㊂研究表明,萜烯合成途径活化水平不同是导致东方百合(浓香型)和亚洲百合(淡香型)香味差异的一个重要原因[8]㊂但目前对于百合萜烯合成调控机制尚未清楚解析㊂萜类化合物是由异戊二烯(C 5)基本单元组成,C 5单元的合成前体物质为异戊二烯焦磷酸(i s o p e n t e n y l p y r o p h o s ph a t e ,I P P )㊂I P P 的合成主要包括两条途径,分别是在细胞质中以倍半萜合成为主的甲羟戊酸(MV A )途径和在质体中以单萜合成为主的甲基赤藓糖醇磷酸(M E P )途径[9]㊂由于单萜类化合物是百合花香的主要成分,因此对M E P 途径关键酶基因的功能解析成为实现百合花香合成调控的前提㊂近年来,对于M E P 途径关键酶基因的研究越来越多,在金鱼草(A n t i r r h i n u m m a j u s )[10]㊁百合㊁薰衣草(L a v a n -d u l aa n g u s t i fo l i a )[11]等植物中多个关键基因被克隆出来,并且部分基因也已被证明在单萜合成中起关键作用㊂在百合中,L i T P S ㊁L i D X S ㊁L i D X R ㊁L i M C T 等M E P 途径基因已被克隆[12-14],表达模式和功能也逐渐被解析,但尚有多个基因未被鉴定㊂在M E P 途径中,2-C -甲基赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(M C S )催化二磷酸胞苷-2-C -甲基-D -赤藻糖醇-2-磷酸(C D P -M E P )生成2-C -甲基-D -赤藻糖醇-2,4-环二磷酸(M E P -c P P ),是合成单萜的关键步骤㊂该基因已在长春花(C a t h a r a n t h u s r o s e u s )[15]㊁盾叶薯蓣(D i -Copyright ©博看网. All Rights Reserved.o s c o r e a z i n g i b e r e n s i s)[16]㊁青蒿(A r t e m i s i a a n-n u a)[17]等植物中相继被克隆出来,且在长春花㊁盾叶薯蓣和青蒿中都已被证明其对萜类物质合成具有重要作用㊂但M C S基因在百合中尚未被克隆,对其表达模式和功能还不清楚㊂本研究选用东方百合 西伯利亚 为材料,克隆L i M C S基因,通过生物信息学㊁荧光定量P C R (q R T-P C R)及亚细胞定位等,预测其特征及功能,并明确其表达模式,为揭示L i M C S基因在 西伯利亚 百合单萜类物质合成中的作用和功能奠定基础㊂1材料与方法1.1试验材料本试验选用的植物材料为 西伯利亚 百合(L i l i u m S i b e r i a )实生苗,种球购自北京荷景良苑贸易有限公司,种植于北京农学院东大地(40ʎ5'24ᵡN,116ʎ17'55ᵡE)单坡面温室中㊂试验选取3株无病虫害㊁生长健壮㊁均高100c m的植株,在不同的花期及在盛花期的不同器官和组织进行采样㊂采样分为花蕾期㊁半开期㊁盛开期和衰败期4个时期,在盛花期采集根㊁茎㊁叶㊁外花被片㊁内花被片㊁花药㊁子房㊁花柱㊁花丝的样品,每组样品设置3个重复㊂置于液氮中速冻,-80ħ保存㊂1.2 西伯利亚 百合总R N A的提取及第一条链的合成将样品在灭菌及用液氮遇冷过的研钵中进行研磨,直至样品研磨成粉末状㊂选用T r a n s Z o l U PP l u sR N A K i t试剂盒(T r a n s G e nB i o t e c h,中国北京)提取 西伯利亚 百合的总R N A㊂用于基因克隆与q R T-P C R的c D N A第一条链合成分别选用T r a n s S c r i p t O n e-S t e p g D N A R e m o v a l a n d c D N AS y n t h e s i s S u p e rM i x(T r a n s-G e n B i o t e c h,中国北京)与E v o M-M L V R T P r e m i x f o r q P C R试剂盒(A c c u r a t eB i o l o g y,中国湖南),按照说明书进行,反应完成后将其置于-20ħ冰箱中保存㊂1.3L i M C S基因的克隆及验证基于前期测得 西伯利亚 百合转录组数据[6],从中调取M C S基因,通过S n a p G e n e设计全长扩增引物(表1)㊂P C R扩增使用制备好的c D N A为模板进行,P C R反应体系为:上下游引物各1μL,c D N A模板1μL,2ˑA8F a s t H i F i P C R M a s t e rM i x12.5μL,d d H2O9.5μL,共25μL的体系㊂P C R反应条件为:95ħ预变性3 m i n,95ħ变性10s,55ħ退火15s,72ħ延伸20s,进行35个循环,最后72ħ延伸5m i n㊂将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳实验进行验证㊂随后使用50μL体系进行P C R扩增,将产物使用E a s y P u r e Q u i c k G e lE x t r a c t i o n K i t(T r a n s G e n B i o t e c h,中国北京)进行回收纯化,纯化后的D N A片段置于-20ħ冰箱中保存,备用㊂将得到的目的片段连接至P c l o n e007载体上,转化至大肠杆菌D H5α(E s c h e r i c h i ac o l i)菌株,挑取阳性克隆,扩大培养后,用菌液P C R的方式进行初步验证,选取符合要求的菌液送至华大基因公司进行测序㊂1.4L i M C S生信分析使用生物信息学技术对 西伯利亚 百合L i M C S相关生物信息进行分析预测(表2)㊂1.5L i M C S的亚细胞定位将L i M C S终止子去除后,使用N i m b l eC l o-n i n g[18]的通用接头序列设计引物G-L i M C S-F㊁G-L i M C S-R(表1),以L i M C S质粒为模板以50μL体系进行P C R扩增,同时使用2ˑS e a m L e s s M i x酶切载体p N C-G r e e n-S u b N,将两个产物分表1 西伯利亚 百合L i M C S基因克隆㊁亚细胞定位和表达分析引物序列T a b l e1P r i m e r s f o r g e n e c l o n i n g,s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o na n d e x p r e s s i o na n a l y s i s o f L i M C S引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e q u e n c e(5'ң3') L i M C S-F A T G G C T T C T T C T C T C T C C T TL i M C S-R T C A C T T C C T C A T C A G A A G A A C A A CG-L i M C S-F A G T G G T C T C T G T C C A G T C C T A T G G C T T C T T C T C T C T C C T TG-L i M C S-R G G T C T C A G C A G A C C A C A A G T C T T C C T C A T C A G A A G A A C A A CL i M C S-Q-F G T T G A T C C T C C A G A A G C C G A A GL i M C S-Q-R A G T G T G A G C A G C G A T A C T A C G Aβ-A c t i n-F C G G T G T C T G G A T T G G A G G G T C Aβ-A c t i n-R C T T C C T G T G G A C G A T G G C T G G A㊃289㊃西北农业学报31卷Copyright©博看网. All Rights Reserved.表2 西伯利亚 百合L i M C S基因生物信息预测软件及网站T a b l e2S o f t w a r e a n dw e b s i t e f o r p r e d i c t i n g t h e b i o l o g i c a l i n f o r m a t i o no f L i M C S生物信息B i o l o g i c a l i n f o r m a t i o n相关软件及网站R e l a t e d s o f t w a r e a n dw e b s i t e开放阅读框O p e n r e a d i n g f r a m e h t t p://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/O r f f i n d e r蛋白序列比对P r o t e i n s e q u e n c e a l i g n m e n t h t t p s://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i和D N AMA N 进化树构建E v o l u t i o n a r y t r e e c o n s t r u c t i o n M E G A7.0理化性质预测P r e d i c t i o no f p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m二级结构预测P r e d i c t i o no f s e c o n d a r y s t r u c t u r e N P S A-P R A B I三级结构预测T h e p r e d i c t i o no f t e r t i a r y s t r u c t u r e h t t p s://s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g信号肽预测P r o t e i n s i g n a l p e p t i d e p r e d i c t i o n h t t p s://w w w.d e t a i b i i o.c o m/t o o l s/s i g n a l-p e p t i d e.h t l 跨膜信息预测T r a n s m e m b r a n e p r e d i c t i o n h t t p s://w w w.d e t a i b i i o.c o m/t o o l s/t r a n s m e m b r a n e.h t m l 磷酸化位点预测P r e d i c t i o no f p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s N e t P h o s3.1S e r v e r别回收纯化后进行同源克隆,构建p N C-G r e e n-S u b N-L i M C S载体,送华大基因测序㊂测序结果比对成功后将其转入农杆菌感受态G V3101中,使用注射法侵染烟草叶片,在激光共聚焦显微镜下进行观察㊂1.6L i M C S的时空表达分析根据克隆得到的L i M C S基因,利用S n a p-G e n e设计该基因的荧光扩增引物(表1)㊂以90~100n g用于q R T-P C R的c D N A作为反应模板配制反应溶液,再加入上下游引物各0.4μL,2ˑS Y B RG r e e nP r o T a q H SP r e m i x10μL,最后使用R N a s e f r e ew a t e r定容至至20μL,随后将配制好并混匀的反应溶液置于荧光P C R仪(B i o-R a d-i Q5)中进行q R T-P C R分析㊂将得到的数据依据相对表达量公式2-ΔΔC t并使用i Q5㊁M i-c r o s o f tE x c e l和S P S S等软件对L i M C S基因在 西伯利亚 百合中时空表达的试验结果进行计算分析㊂2结果与分析2.1 西伯利亚 百合L i M C S的克隆从全长L i M C S基因的电泳图(图1)可以看出,克隆的片段为500~750b p,随后将其产物回收纯化,与P c l o n e007载体链接并转化到D H5α上,经菌落P C R验证后送往华大基因公司进行测序,将结果与转录组中的基因进行序列比对,以此确定L i M C S的最终序列㊂2.2L i M C S核苷酸和氨基酸序列分析2.2.1L i M C S核苷酸序列及其编码蛋白保守结构分析使用N C B I网站中的O p e n R e a d i n g F r a m eF i n d e r功能,确定L i M C S最大的开放阅读框为669b p,利用D N AMA N软件将其翻译成氨基酸序列(图2)㊂L i M C S蛋白是由222个氨基酸构成,属于2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-环二磷酸合酶(2-C-m e t h y l-D-e r y t h r i t o l-2,4-c y c l o-d i p h o s p h a t e s y n t h a s e(M E C D P))超家族(图3)㊂M.D L2000D N A M a r k e r;1.L i M C S基因全长电泳M.D L2000D N A M a r k e r;1.F u l l l e n g t ho f L i M C S g e n e图1 西伯利亚 百合L i M C S基因全长电泳扩增F i g.1A g a r o s e g e l f o r a m p l i f i c a t i o no ff u l l l e ng t ho f L i M C S g e n e2.2.2 L i M C S氨基酸序列同源性比对及系统进化树构建分析使用N C B I中的B l a s t和D N A-MA N软件将L i M C S与其他植物M C S氨基酸序列的同源性进行比对,发现其与盾叶薯蓣D i M C S 的相似度极高,与芝麻(S e s a m u m i n d i c u m) S e M C S㊁海枣(P h o e n i x d a c t y l i f e r a)P h M C S㊁毛果杨(P o p u l u s t r i c h o c a r p a)P o M C S㊁椰子(C o c o s n u c i f e r a)C o M C S㊁油棕(E l a e i s g u i n e e n s i s)E l-a M C S㊁香蕉(M u s a a c u m i n a t a)M u M C S㊁荸荠(E l e o c h a r i sd u l c i s)E l e M C S等植物M C S蛋白的相似度较高(图4)㊂为了进一步研究 西伯利亚 百合L i M C S与其他植物的M C S同源基因的系㊃389㊃8期张茜等:百合花香合成相关基因L i M C S的克隆㊁定位和表达特性研究Copyright©博看网. All Rights Reserved.统进化关系,使用M E G A 7.0软件构建L i M C S 与其他植物的M C S 氨基酸序列的进化树(图5),发现其与盾叶薯蓣同源性最高并形成一个小亚群,和荸荠㊁香蕉㊁海枣㊁椰子和油棕等植物的亲缘性较近㊂图2 西伯利亚 百合L i M C S 基因核苷酸序列以及其氨基酸序列F i g .2 T h e n u c l e o t i d e a n da m i n o a c i d s e qu e n c e o f L i M C S g e ne 图3 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白保守结构F i g.3 T h e c o n s e r v e dd o m a i n s o fL i M C S 2.2.3 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白理化性质利用E x P A S y -P r o t P a r a m 在线工具对L i M C S 蛋白的理化性质进行预测,该基因共编码222个氨基酸,其中含量最高的为亮氨酸(L e u ),占13.5%;其次是丙氨酸(A l a )㊁脯氨酸(P r o)和丝氨酸(S e r ),分别为11.3%㊁11.3%和9.0%,其正电残基数(A s p +G l u )与负点残基数(A r g +L y s )分别为21和23,为亲水性不稳定蛋白(表3)㊂2.2.4 L i M C S 二级和三级结构分析 利用N P S A -P R A B I 在线软件对L i M C S 蛋白二级结构进行预测,发现其由70个α-螺旋(a l ph ah e l i x ,H h )㊁28个延伸链(e x t e n d e ds t r a n d ,E e )㊁9个β-转角(b e t a t u r n ,T t )及115个无规卷曲(r a n d o mc o i l ,C c)组成(图6)㊂由二级结构卷曲折叠形成L i M C S 的三级结构模型,以2p m p .1.A (拟南芥异戊二烯生物合成途径中2-C -甲基-D -赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶的结构)为模板,二者相似度高达89.31%,相似度大于60%被认为非常准确,其中序列覆盖率为72%,C -β相互作用值为2.54(图7)㊂2.2.5 L i M C S 蛋白信号肽和跨膜结构预测分析利用信号肽预测网站对L i M C S 进行蛋白质信号肽的预测,发现该蛋白不含信号肽(图8)㊂随后,又使用跨膜信息预测网站预测该蛋白的跨膜结构,发现该蛋白不含跨膜结构(图9)㊂由以上结果推断,该蛋白不属于信号蛋白㊂㊃489㊃西 北 农 业 学 报31卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.黑色.同源性=100%;粉色.同源性ȡ75%;蓝色.同源性ȡ50%;D i M C S .A S L 70633.1;S e M C S .X P _011073285.1;P h M C S .X P _008805558.1;P o M C S .X P _002304519.1;C o M C S .K A G 1362373.1;E l a M C S .X P _010933967.1;M u M C S .X P _009397837.1;E l e M C S .QMU 23681.1B l a c k .T h eh o m o l o g y =100%;P i n k .T h eh o m o l o g y ȡ75%;B l u e .T h eh o m o l o g y ȡ50%;D i MC S .A S L 70633.1;S e M C S .X P _011073285.1;P h M C S .X P _008805558.1;P o M C S .X P _002304519.1;C o M C S .K A G 1362373.1;E l a M C S .X P _010933967.1;M u M C S .X P _009397837.1;E l e M C S .QMU 23681.1图4 L i M C S 基因编码的氨基酸序列与其他植物同源性比对F i g .4 T h e h o m o l o g y c o m p a r i s o nb e t w e e na m i n o a c i d s e q u e n c e s e n c o d e db y Li M C S g e n e a n dM C S i no t h e r p l a n ts 图5 西伯利亚 百合L i M C S 基因编码氨基酸序列的系统进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e o f a m i n o a c i d s e q u e n c e e n c o d e db y Li M C S g e n e 表3 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白理化性质分析T a b l e 3 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o pe r t i e s o fL i M C S p r o t e i n 蛋白名称P r o t e i n n a m e 分子质量/uM o l e c u l a r m a s s 总原子数T o t a l n u m b e r o f a t o m s分子式F o r m u l a理论等电点T h e o r e t i c a l pI 脂肪系数A l i p h a t i c i n d e x 不稳定指数I n s t a b i l i t y i n d e x 亲水系数G R A V Y L i M C S23636.423365C 1052H 1703N 303O 299S 88.5100.2753.19-0.048㊃589㊃8期张 茜等:百合花香合成相关基因L i M C S 的克隆㊁定位和表达特性研究Copyright ©博看网. All Rights Reserved.蓝色为α-螺旋;红色为延伸链;绿色为β-转角;紫色为无规卷曲T h eb l u e i s α-h e l i x ;R e d i s e x t e n d e d s t r a n d ;G r e e n i s b e t a t u r n ;P u r pl e i s r a n d o mc o i l 图6 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白质二级结构的预测F i g .6 P r e d i c t i o no f s e c o n d a r ys t r u c t u r e o fL i M CS 图7 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白质三级结构的预测F i g .7 T h e p r e d i c t i o no f t e r t i a r y st r u c t u r e o fL i M CS 图8 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白质信号肽预测F i g .8 P r o t e i n s i g n a l p e pt i d e p r e d i c t i o no fL i M CS 图9 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白质跨膜螺旋预测F i g.9 T r a n s m e m b r a n e p r e d i c t i o no fL i M C S 2.2.6 L i M C S 蛋白磷酸化位点预测分析 通过在线软件N e t P h o s 3.1S e r v e r 对 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白磷酸化位点进行预测,发现该蛋白可能含有20个丝氨酸㊁4个苏氨酸和1个酪氨酸(图10)㊂图10 西伯利亚 百合L i M C S 蛋白磷酸化位点预测F i g .10 P r e d i c t i o no f p r o t e i n p h o s p h o r yl a t i o n s i t e s o fL i M C S 2.3 L i M C S 亚细胞定位分析图11显示L i M C S 亚细胞定位的结果,通过激光共聚焦显微镜观察发现融合蛋白与叶绿体荧光场重合,说明其蛋白特异性定位于叶绿体中㊂2.4 L i M C S 时空表达模式分析L i M C S 在百合中的时空表达模式显示(图12),L i M C S 的表达量随着百合花的发育整体呈现先升高后降低的规律㊂在半开期L i M C S 基因的表达量达到顶峰,其次为盛开期与衰败期,花蕾期表达量最低,仅为半开期的1/3㊂西伯利亚 百合L i M C S 基因在不同器官和组织中的表达量也不相同(图13)㊂L i M C S 基因在花器官中的表达总和远远大于根㊁茎㊁叶,占总量的4/5,而花瓣中的表达量占总量的1/2㊂L i M C S 在外瓣中表达量最高,内瓣其次,叶中表达量仅次于花瓣㊂3 讨论单萜类化合物是西伯利亚 百合花香的主要㊃689㊃西 北 农 业 学 报31卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.从左到右依次为目标蛋白荧光通道;明场;叶绿体荧光通道;叠加场T h e r e a r e t h e t a r g e t p r o t e i n f l u o r e s c e n c e c h a n n e l ;B r i g h t f i e l d ;C h l o r o p l a s t f l u o r e s c e n c e c h a n n e l a n dm e r g e d f r o ml e f t t o r i gh t 图11 西伯利亚 百合L i M C S 亚细胞定位F i g.11 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fL i M CS 不同小写字母表示差异显著(P <0.05)D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e s (P <0.05)图12 西伯利亚 百合L i M C S 在不同花期的表达分析F i g .12 E x p r e s s i o na n a l y s i s a t d i f f e r e n t f l o w e r i n g s t a ge s of L i M CS 不同小写字母表示差异显著(P <0.05)D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e s (P <0.05)图13 西伯利亚 百合盛开期L i M C S 在不同器官和组织的表达分析F i g .13 E x p r e s s i o na n a l y s i s i nd i f f e r e n t p l a n t o r g a n s a n d t i s s u e s o f L i M C S i n t h e f l o w e r i n g s t a ge 组成物质㊂M C S 是植物单萜物质合成途径中催化第五步反应所需的酶,该途径的产物可以催化生成单萜类化合物的合成前体物质I P P ㊂因此,M C S 基因的克隆及其功能的挖掘,能为 西伯利亚 百合花香单萜类挥发物的合成及调控机制的研究提供依据㊂通过对一系列结构基因的克隆,不断深入花香调节机制的研究,从而实现花香的人为调控及后续的育种工作㊂本研究克隆出了西伯利亚 百合中的L i M C S 基因,并通过生物信息学技术对其编码蛋白的理化性质㊁结构功能㊃789㊃8期张 茜等:百合花香合成相关基因L i M C S 的克隆㊁定位和表达特性研究Copyright ©博看网. All Rights Reserved.进行了预测和分析,同时明确了其表达位置及表达模式㊂通过氨基酸序列比对分析,得知L i M C S与盾叶薯蓣d z M C S具有较高的同源性㊂在盾叶薯蓣中,通过构建d z M C S基因的大肠杆菌表达载体,最终加强了大肠杆菌的M E P途径,尤其促进了胡萝卜素的合成与积累[16]㊂同时,L i M C S具有保守结构域,表明该基因编码的蛋白是具有生物功能的蛋白,为L i M C S基因的功能研究提供了理论依据㊂L i M C S基因编码的蛋白质定位于烟草叶片表皮细胞的叶绿体中,这与单萜在质体中经M E P途径合成相一致㊂ 西伯利亚 百合花香由花蕾期开始积累,在盛开期达到顶峰[19],而L i M C S基因主要在半开期表达量最高,推测该基因作为M E P途径上游基因,在半开期进行了大量的转录积累,逐步合成下游单萜产物,最终在盛花期花香得到大量释放㊂该基因主要在花瓣中发挥作用,这与 西伯利亚 百合M E P途径中上游L i D X S基因㊁L i D X R基因和下游单萜合酶L i T P S基因的表达模式基本吻合[12-13]㊂目前, M C S基因在部分植物中已有研究㊂长春花M C S 基因的过表达,增加了单萜吲哚生物碱的含量,这表明增加M C S基因的表达将有助于代谢向下游流动[15]㊂将青蒿A a M C S基因在拟南芥中超表达,类胡萝卜素㊁叶绿素a和叶绿素b含量显著增加[17]㊂这些研究都表明M C S基因在萜烯类物质合成中起重要作用㊂L i M C S基因的克隆不仅扩充了百合的基因库,为今后花香调控相关的基因工程研究提供目的基因,还为萜烯类合成释放分子机制的深入探究奠定了基础㊂但本研究仅阐述了该基因相关的理化性质和表达模式,缺乏关于L i M C S基因调节 西伯利亚 百合花香合成机制的研究,后续将会使用病毒诱导的基因沉默(V I G S)㊁瞬时过表达㊁启动子克隆等分子生物学技术对L i M C S基因的功能展开更深入的探究,最终明确L i M C S 基因在 西伯利亚 百合花香合成中的作用机制㊂参考文献R e f e r e n c e:[1] MA J E T I CCJ,R A G U S O R A,A S HMA N T L.T h e s w e e ts m e l l o f s u c c e s 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n e5'-d i p h o s p h o )-2-C -m e t h y l e r y-t h r i t o lk i -n a s e g e n e ,2-C -m e t h y l e r y t h r i t o l -2,4-c y c l o d i p h o s p h a t e s yn -t h a s e g e n ef r o m A r t e m i s i a a n n u a L [D ].C h o n g q i n g:S o u t h w e s tU n i v e r s i t y,2016.[18] Y A NP ,Z H E N G Y ,S H E N W ,e t a l .N i m b l e c l o n i n g:a s i m -p l e ,v e r s a t i l e ,a n d e f f i c i e n t s y s t e m f o r s t a n d a r d i z e dm o l e c u l a r c l o -n i n g [J ].F r o n tB i o e n g B i o t e c h n o l o g y ,2020,7:460.[19] 张辉秀,冷平生,胡增辉,等. 西伯利亚 百合花香随开花进程变化及日变化规律[J ].园艺学报,2013,40(4):693-702.Z HA N G H X ,L E N G P S H ,HU Z H ,e ta l .T h ef l o r a ls c e n t e m i t t e d f r o m L i l i u m S i b e r i a a t d i f f e r e n t f l o w e r i n g s t a ge s a n dd i u r n a l v a r i a t i o n [J ].A c t a H o r t i c u l t u r a eS i n i -c a ,2013,40(4):693-702.C l o n i n g ,L o c a l i z a t i o na n dE x pr e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c s o f F l o w e r F r a g a n c e S yn t h e s i sR e l a t e dG e n e L i M C S i n L i l i u m Z H A N G X i 1,2,L U OJ i n g l i n 2,WA N G H a o n a n 1,2,L IY i n g y i n g 1,2,L E N GP i n g s h e n g 1,2a n dHUZ e n gh u i 1,2(1.B e i j i n g A d v a n c e d I n n o v a t i o nC e n t e r f o rT r e eB r e e d i n g b y M o l e c u l a rD e s i g n ,B e i j i n g102206,C h i n a ;2.C o l l e g e o fL a n d s c a p eA r c h i t e c t u r e ,B e i j i n g U n i v e r s i t y o fA g r i c u l t u r e ,B e i j i n g102206,C h i n a )A b s t r a c t T h e f l o r a l v o l a t i l e s o f L i l i u m a r e c o m p o s e do f a l a r g en u m b e ro f t e r p e n o i d s ,a m o n g wh i c h 2-C -m e t h y l -D -e r y t h r i t o l -2,4-c y c l o p y r o p h o s p h a t es y n t h a s e (M C S )i so n eo f t h ek e y e n z ym e s i nt h e m o n o t e r p e n e s y n t h e s i s 2-C -m e t h y l -D -e r y t h r i t o l 4-p h o s p h a t e p a t h w a y .I no r d e r t o f u r t h e r e x pl o r e t h e -r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fM C So n l i l y f l o r a l f r a g r a n c e s y n t h e s i s ,w e c l o n e d t h e L i M C S g e n eo f L i l i u m S i b e r i a .S u b s e q u e n t l y ,t h eb i o i n f o r m a t i c s a n a l ys i sw a s c a r r i e do u t ,a n d t h e s u b c e l l u l a r l o c a t i o nw a s u s e d t od e t e r m i n e t h e l o c a t i o no f t h e p r o t e i ne n c o d e db y t h e g e n e ,a n d f i n a l l y t h e s p a t i o t e m po r a l e x -p r e s s i o n p a t t e r no f t h e g e n ew a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g to t h e q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m eP C R.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o p e n r e a d i n g f r a m e o f t h e L i M C S g e n ew a s 669b p ,e n c o d i n g 222a m i n o a c i d s ,a n d h a d t h eh i g h e s t s i m i l a r i t y w i t h D i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s .L i M C S p r o t e i nw a s l o c a t e d i n t h e c h l o r o p l a s t s o f t o b a c c o l e a f e p i d e r m a l c e l l s .T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f L i M C S g e n ew a sh i g h e s t i n t h e e a r l y f l o w e r i n gs t a g e a n d l o w e s t i n t h e b u d s t a g e .D u r i n g f l o w e r i n g ,t h e e x p r e s s i o no f t h i s g e n ew a s h i g h e s tm a i n l y i n p e t a l s ,b u t l o wi no t h e r p a r t s .T h er e s u l t s p r o v e dt h a tL i M C S m a y b e i n v o l v e d i nt h es yn t h e s i so f m o n o t e r p e n o i d so f l i l i u mf r a g r a n c e ,w h i c h l a i da t h e o r e t i c a l f o u n d a t i o n f o r t h e s u b s e qu e n tu s eo f g e -n e t i c e n g i n e e r i n g m e t h o d s t o r e g u l a t e t h e r e l e a s e o f l i l y f r a gr a n c e .K e y w o r d s L i l i u m S i b e r i a ;L i M C S ;G e n e c l o n i n g ;E x p r e s s i o na n a l y s i s R e c e i v e d 2021-08-20 R e t u r n e d 2021-10-15F o u n d a t i o n i t e m T h e N a t i o n a l K e y R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t P r o gr a m o f C h i n a (N o .2018Y F D 1000400);t h eN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (N o .31201645);t h eB e i j i n g N a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o n (N o .6172006).F i r s t a u t h o r Z HA NG X i ,f e m a l e ,m a s t e rs t u d e n t .R e s e a r c ha r e a :r e g u l a t i o n m e c h a n i s m o f l i l y fr a -g r a n c e .E -m a i l :Z h a n gx i 0522@126.c o m C o r r e s p o n d i n g a u t h o r HU Z e n g h u i ,m a l e ,p r o f e s s o r .R e s e a r c ha r e a :p l a n t p h y s i o l o g y a n de c o l o g y .E -m a i l :b u a h u z e n gh u i @163.c o m (责任编辑:潘学燕 R e s p o n s i b l e e d i t o r :P A NX u e ya n )㊃989㊃8期张 茜等:百合花香合成相关基因L i M C S 的克隆㊁定位和表达特性研究Copyright ©博看网. 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辽宁省东方百合鲜切花温室栽培管理技术作者：王丹菲赫菲来源：《现代园艺》2011年第08期摘要：文章主要从品种选择、设施准备、土壤处理、种球准备、种植、种植后管理及采收等方面详细介绍了辽宁省东方百合温室栽培管理技术，为东方百合鲜切花规模生产提供理论依据。

关键词：东方百合；栽培技术百合（Lilium spp.）为百合科（Liliaceae）百合属多年生草本植物，是世界上著名的观赏花卉。

因其花姿优美、植株挺秀、瓶插期长，已经逐步取代唐菖蒲成为世界上第四大切花。

用于切花栽培的百合大致可分为3类，即亚洲百合杂种、东方百合杂种和麝香百合杂种。

其中东方百合杂种中的“索邦”和“西伯利亚”是目前世界上广为栽培的两个品种，占市场份额70%左右。

本文结合辽宁省东方百合的种植情况，针对存在问题，总结出适合辽宁省的东方百合栽培技术，为切花百合规模化生产提供依据。

1 栽培品种选择东方百合杂交系栽培品种主要有西伯利亚（Siberia白）、索蚌（Sorbonne粉红）、马可波罗（Marco Polo浅粉红）、元帅（Acapulco粉）、卡萨布兰卡（Casa Balanca白）、红星球战士（Star Fighter 深粉）、辛普隆（Simplon白）、伯尼尼（Bernini深粉）、殘星（Mero Star深粉红）、提伯（Tiber粉红）、热情（Con Amore粉）、凝视星空（Star Gazer深粉）等，在辽宁地区均有栽植，栽培面积最大的是“西伯利亚”和“索邦”两个品种，“元帅”和“马可波罗”是由辽宁省农科院花卉研究所引进，虽然栽培面积不大，但呈逐年增加的趋势。

2 栽培设施准备为了实现东方百合的周年栽培生产，建议选择温室栽培，温室朝向选择南偏西5°～10°，温室内需配备风机、湿帘、遮阳网、日光灯等用于升温、降温和补光的设施。

3 栽培土壤处理3.1 改良土壤结构东方百合要求土壤排水性良好、保湿性强、有机质丰富，ph值为5.5～6.5，通过加入动物的粪便和植物的腐殖质等可以增加土壤中有机质含量，最常用的有腐熟的牛马粪、稻壳、秸秆、泥炭等，改良时，每年向土壤表层施入牛粪草炭（稻糠）少量河沙，将有机质均匀地拌入30cm深的土壤，施入过量会起副作用，一般2～3年土壤结构可改良良好。

《‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》篇一西伯利亚百合LiCMK基因克隆及功能分析一、引言西伯利亚百合（Lilium sibiricum）作为一种珍贵的花卉植物，其生长环境和遗传特性吸引了众多科学家的关注。

近年来，随着分子生物学和基因克隆技术的快速发展，关于西伯利亚百合的基因研究也日益深入。

本文旨在介绍西伯利亚百合中LiCMK基因的克隆及其功能分析，为进一步了解该基因的功能及其在植物生长和抗逆性中的作用提供理论基础。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的西伯利亚百合材料采自自然环境下的野生种群，经过分子生物学技术提取其基因组DNA和RNA。

2. 方法（1）基因克隆：通过PCR技术扩增LiCMK基因的cDNA序列，将目的片段与载体连接后转化至大肠杆菌中，筛选阳性克隆并进行测序验证。

（2）功能分析：采用生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析，预测其编码的蛋白质结构和功能；通过构建过表达和沉默载体，分别在植物中实现LiCMK基因的过表达和沉默，观察其对植物生长和抗逆性的影响。

三、实验结果1. LiCMK基因的克隆通过PCR技术成功扩增出LiCMK基因的cDNA序列，与载体连接后转化至大肠杆菌中，经过筛选得到阳性克隆并进行测序验证，确认序列的正确性。

2. LiCMK基因的序列分析通过生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析，发现该基因编码一个具有特定功能的蛋白质。

进一步分析表明，该蛋白质具有跨膜结构和保守的蛋白结构域，可能参与植物的生长和抗逆性等生物学过程。

3. LiCMK基因的功能分析（1）过表达实验：将LiCMK基因构建成过表达载体并转化至植物中，观察其对植物生长的影响。

结果显示，过表达LiCMK 基因的植物表现出更强的生长能力和抗逆性。

（2）沉默实验：通过RNA干扰技术实现LiCMK基因的沉默，观察其对植物生长和抗逆性的影响。

结果显示，沉默LiCMK 基因的植物生长受阻，抗逆性减弱。