免疫分析方法的最新研究进展培训课件

• 至2007年，应用于免疫分析检测 中的各种标记技术:放射物标记、 酶标记、发光标记、荧光标记、金 标记和超顺磁粒子标记等
酶免疫分析方法
• 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫 分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示 踪物, 由高活性的酶催化底物显色或发 光, 达到定量分析的目的。
• 到目前为止, 酶标记法所用的酶大多是 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性 磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。酶通过与 自己的特殊作用底物反应, 而产生典型 的有色沉淀物。
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灵敏度(mol/L)
方法
优点
缺点
10-18
放10射-15免疫
试剂成本低，灵敏度较 高
操作复杂，放射性污染， 有效期短
酶10联-12免疫
试剂成本低，线操性范作围 简单
灵敏度低，适用于定性和 半定量测定
10-9
操作简单，成本较低，
化学发光 灵敏度较高1，05试剂较 工作曲线随时间漂移
时产生能量，多余的能量即为发射光子， 从而产生发光现象。发光强度可以利用发 光信号测量仪器进行检测、分析接收光量 子的产量，根据化学发光标记物与发光强 度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的 含量。
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常见的发光体系
• 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类：
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免疫电泳
疫
技
分术
析
﹛方
法
胶体金免疫技术
标
发光免疫技术(CLIA)
记
铁蛋白免疫技术
免 疫
﹛分
荧光免疫技术(FIA) 放射免疫分析（RIA ）
析
酶免疫分析（EIA）
技
术 免疫分析方法的最新研究进展
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免疫分析标记技术
• 免疫分析标记技术是指以抗原抗体 间的特异性反应为基础,研究标记 以各种标记物(定量信号)来对某种 物质进行定性或定量检测的研究。
酶标
放免 稳荧定光104 发光
时间分辨
灵敏度较高，1试03剂较稳 定 102
操作复杂，发光时间短， 试剂成本高，仪器维护 费用较高
电化学发 光
灵敏度较高，试剂较稳
定
酶标
操作复杂，试剂成本高， 仪器维护费用较高，有 荧光 本放底免干扰发光
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化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发 光分析2个系统。免疫分析系统是将化学发 光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或 抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体 免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫 反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化 学发光物质在碱性介质中经氧化剂的氧化 时释放大量自由能, 产生激发态的中间体， 该激发态的中间体由最低振动能级回到稳 定的基态， 各个振动能级时产生辐射，同
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优点：避免对人体的放射性伤害,环 境的污染 酶标记物较稳定,半衰期可 超过1年. 酶免疫反应通常不需要温 育，不需将与抗体结合的标记药物 同游离的标记药物分开,. 产生的信号 用普通的可见一紫外分光光度计就 可测定,不需昂贵的仪器没备。
缺点：标记酶不像同位素标记物,荧 光标记物那样能直接产生信号,而必 须要何其它试剂,如酶底物,辅酶的参 与,才能完成酶反应,引起吸收光谱等 变化后方可进行测定.
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• 免疫分析法通过对半抗原或抗体 进行标记，利用标记物的生物或 物理或化学放大作用来进行工作， 它集测定的高灵敏性和抗体反应 的强特异性于一体。
• 优点：操作简单、快速、灵敏度 高、特异性强、价廉、样品所需 量少
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非
分 析
λmax为470 nm的蓝光。生物发光体系
的特点是发光效率、灵敏度、选择性 均非常高。
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其他无机氧化剂的化学发光体系
• 近年来，一些科学家就一些无机氧化 剂直接氧化一些物质产生化学发光的 化学发光新体系,如高锰酸钾、铈(Ⅳ)、 过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸盐和铁
氰化钾等在药物分析方面的应用展开 了研究，并取得了一定的成果。
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化学发光免疫分析法
• 化学发光免疫分析是将高灵敏度的化 学发光测定技术与高特异性的免疫反 应相结合, 借以检测抗原或抗体的分析 技术。它兼有发光分析的高灵敏度和 免疫反应的特异性。
• 优点：灵明度高，线性范围宽，光信 号持续时间长，分析方法简便快速， 结果稳定、误差小，安全性好，使用 周期长。
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荧光免疫分析法
• 荧光免疫分析法是以荧光物质标记 抗原或抗体, 形成的标记物发生免 疫反应后, 引起荧光强度发生变化, 从而达到定量分析的目的。
• 目前为止认为比较满意标记物的有: 异硫氰酸荧光素( FITC )、二氯三 嗪氨基荧光素( DTAP)、四乙基罗 丹明( RB200)和四甲基异硫氰酸罗 丹明( TMR ITC ) 。
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• 吖啶类化合物：
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（金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物
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电化学发光体
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生物发光体系
• 北美荧火虫体内的荧光素/荧光素酶是 著名的生物化学发光体系,它由虫荧光 素酶、虫荧光素[D-(-)-2-6’-羧基-2’苯 并噻唑-△2-噻唑啉-4-羧酸]、ATP、 Mg2+及O2所组成。虫荧光素酶在催 化时,首先与虫荧光素酰腺苷酸(由 Mg2+-ATP与虫荧光素复合而成)生成 复合物,然后该复合物放出质子,酶变 构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。 另一生物发光体系是水母发光蛋白,它 不需要加入荧光素酶,只需加入Ca2+ 或Se2+便能通过分子内反应而发出
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总结与展望
• 总之, 免疫学分析技术的发展也就是 标记学的发展。目前, 多种免疫分析 标记方法并存, 相互竞争, 相互补充, 如将EIA 与荧光技术或化学发光技术 结合, 形成荧光酶免疫分析( FEIA) 及 化学发光酶免疫分析( CLEIA ) , 从而 大大提高灵敏度, 增大检测范围。但 不管怎样, 目前还没有一种免疫分析 标记技术是完美无缺的。因此, 各种 标记技术还需要不断发展和完善, 并 且人们还在不断研究, 以开发出更新、 更理想的免疫分析标记技术。
免疫分析方法的最新研究 进展
免疫分析法起始于本世纪50 年 代, 首先应用于体液大分子物质的分 析, 1960 美国学者Yalow 和Berso n 等将放射性同位素示技术和免疫反
应结合起来测定糖尿病人血浆胰岛 素浓度, 开创了放射免疫分析方法的 先河。同年,Oliv er 将地高辛同牛血 清白蛋白结合, 使之成为人工抗原, 免疫动物后成功获得了抗地高辛抗 体, 从而开辟了用免疫分析法测定小 分子药物的新领域。