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高效液相色谱结果分析-第二讲

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第2章 高效液相色谱分析法

第2章 高效液相色谱分析法

4. 选择流动相时应注意的几个问题
（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧 化铝固定相等。）
（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
信号采集/转换器
检测器
A泵
B泵
(2) 梯度洗脱装置
•利用两台高压输液泵，将两种 不同极性的溶剂按一定的比例送 入梯度混合室，混合后进入色谱 柱。
•可以根据设定的程序改变溶剂 配比，从而改变流动相的极性。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
a. 准备状态：样品装入样品环，流动相不进入样品环； b. 进样状态：流动相流进样品环，将样品带入色谱柱。
液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型载体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型载体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的
(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
分离柱填充物的种类多样，分离机理各不相同，可将高 效液相色谱法分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化 学键合色谱法，离子交换色谱法等。（后面详细讲解）
(5) 液相色谱检测器
a. 紫外-可见光检测器 应用最广，有紫外-可见光吸收的有机化合物均可检测。 工作原理类似紫外-可见分光光度计，基于朗伯比尔定率： A=lg(1/T)=kc A -- 吸光度 c -- 样品浓度

高效液相色谱分析ppt课件

高效液相色谱分析ppt课件
liquid-solid adsorption chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next

高效液相色谱讲座Ⅱ高效液相色谱基本参数和基础理论(下)

高效液相色谱讲座Ⅱ高效液相色谱基本参数和基础理论(下)
讲
座
高效液相 色谱讲 座
高效液相色谱 基本参 数和基础理论 （ 下）
张玉奎 李秀珍＊ 卢佩章
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
２ ５ 分离效能总指标—分离度 Ｋ和 Ｒ － １ １ ．定义：任何色谱过程的目的是要分
对两相邻峰， ｔ２ １） ／
ｔ２ １（＝ ｔ ，故 有 ／ ２ ／ １
离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要
表２６ 柱长不同 － 时峰 容量与分析时 间的关 系 Ｈ ０ 米，ｕ 毫米／ Ｋ ＝１ １ ＝１微 ⒚ ＝１ 秒，１ ． ９
则必须用长柱子进行分离分析。
２７ 最佳操作条件的选择 －
１ ．保留值随冲洗剂组成变化规律 保留值变化规律是解决最佳条件选择和
色谱定性的基础。在二元体系的液 相色谱
中，目前有四种类型的方程：
其中 Ｓ为柱系统选择性指标
＋１ （－９ ６ ２４－）
图２ 给出了不同柱长时峰容量与分析时间 －７ 的关系曲线，表２ 列出由式（－９４所计 －５ ２４－ 算的保留时间随 值的变化。从表中可看出， 当 ＝ 时，出３个峰仅需６ １ ０ 分钟，而当 ＝ 由 Ｎ 为一常数，Ｋ１ 于 由分析精度的要求所 决定，因此对于欲分离的混合物中任一 “ 物
因子，Ｃ 是强溶剂Ｂ的 Ｂ
浓度。ａｂｃ分 别为各
方程的常数。方程 （－ ２ ５－ ０ １是由Ｓ ｙ ｅ 应用 ｎ ｄｒ 顶替吸附模型导出的液 固色谱保留方程。方程
（－０２是近似的溶解 ２５－）
度参数理论导出的保留
值方程。方程（－０３ ２５－）
是Ｓ ｏｔ ｃｔ 和Ｋｕｅａ在多 ｅｒ 层吸附模型基础上导出
ｌｇ Ｂ ａ ｂ Ｂ ｏｋＡ＝ － ｏ ｌ ｇＣ
表２５ － 峰保留时间随 值的变 化

《高效液相色谱》 (2)幻灯片

《高效液相色谱》 (2)幻灯片
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
分配色谱–别离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基 团 离子交换基团
中分子局部进入多孔中，一般保存 小分子完全进入多孔中，长时间保存。
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球， 经化学键合处理，不随压力及溶剂改变 尺寸，（高效排阻色 谱）
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂， 流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。
分离对象 离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理
根大据分样子品不分能子进尺入寸多大孔小中分，离不被保存，随 Vm流出
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所 组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰 基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正 相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱 体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相 是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲 醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
O S SO ii HC O S lO i C H S l i3 ) ( 2 R CO H SO i Si3 ) ( 2 R CH

高效液相色谱分析精品文档

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分析法
high performance liquid chromatograph
§3-2 主要分离类型与原理
basic principle and main separating types
一、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
二、液-固吸附色谱
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
三、分离条件的选择
2019/10/26
一、液相色谱固定相
stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对色谱法固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
2019/10/26
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-1 概述
பைடு நூலகம்
一、高效液相色谱法特点
Characteristic of HPLC 二、影响色谱峰扩展及分离的因素
The factors that influence peak expansion and sepration
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/10/26
2019/10/26
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因 子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/10/26

《高效液相色谱分析》课件

《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
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3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接 近的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度, 应控制在100%左右(95%～105%)。
绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相 应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收 率。绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测 物质损失严重。
保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最 大值所需的时间.
死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时 间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸 收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色 谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.
调整保留时间：tR’＝ tR－t0
三.液相色谱图名词术语(4)
保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出 现峰最大值所需的流动相体积.
死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.
调整保留体积：VR’＝VR－V0＝tR’ • FC
三.色谱图名词术语(1)
色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响 应信号.
峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离.
响应值 (mV)
←色谱峰
峰底 时间(分)
基线 ↓
峰高
三.色谱图名词术语(2)
切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切 线与峰底相交两点之间的距离.
色谱柱的选择 流动相 流速 检测波长 柱温 进样量
2.绘制标准工作曲线
标准曲线是定量分析的根本依据. 药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!

tR

2

或
N＝5.54
tR W1/
2
2
标准偏差σ
进样
半峰宽
峰宽
塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡
图示中塔板数为3.
四.色谱峰检测
峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个 “阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采 用下面两种方式判别峰讯号的变化：
结果处理与分析 第二部分
高效液相色谱
(High performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、色谱数据处理 二、色谱图 三、色谱图名词术语 四、色谱峰检测 五、HPLC测定步骤与内容
一.色谱数据处理
色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数 字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。
Fc: 流动相的流速 mL/min.
三.液相色谱图名词术语(5)
谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象.
三.液相色谱图名词术语(6)
拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. 前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. 鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰.
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价， 如高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取
样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用
偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异
Excellent t = 1.0 - 1.05
Acceptable t = 1.2
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线 波动.
依 照 信 号 斜 率 的 变 化检测信号
依 照 积 分 面 积 检 测 峰信号
切线 色谱峰的判断 最小面积
五.HPLC 测定步骤与内容
1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速、 检测波长、柱温及进样量Ｓ等。
2.绘制标准工作曲线 3.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定
1.确定色谱条件
半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间 的距离 .
峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值.
切线 半峰宽 切线峰宽
响应值
峰面积
色谱峰的判断 (最小面积)
时间
三.液相色谱图站
色谱仪信号输出图
数据处理原理
峰的检测 数据采集 基线校正和重叠峰的分离
数据处理方法
自动处理 人工修正
二.色谱图 (Chromatogram)
色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间
样品组分分离示意图
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试 验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
M - 空白
回收率 R =
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变 化.
基线
基线噪音
基 线 飘 移
三.液相色谱图名词术语(8)
标准偏差(σ)(Standard deviation): 0.607倍峰
高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的

是为了计算柱效率(柱效)。 柱效（理论塔板数） ：N ＝