梅毒螺旋体抗体凝集实验(TPPA)操作程序

梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）1.原理梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）是用超声裂解梅毒螺旋体抗原致敏明胶粒子，致敏粒子与待检血清（浆）中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的颗粒凝集。

2.方法2.1仪器耗材：1)TPPA检测试剂盒2)移液器3)保湿盒2.2检测流程：1)试剂准备：试验前30分钟将待检标本和试剂从冰箱中取出，恢复至室温。

2)加稀释液：每份样本作4孔，用移液器将血清稀释液滴入微量反应板第1孔（100μl），从第2孔-第4孔各滴25μl。

3)样本稀释：用移液器取待检血清25μl置第1孔中，然后以2n 的方式从第1孔稀释至第4孔。

4)加对照液：用移液器在第3孔滴入25μl未致敏粒子；在第4孔滴入25μl致敏粒子。

5)混合：以不会导致微量反应板内容物溅出的强度混合30秒钟。

6)反应：加盖置湿盒内，于室温（15℃-30℃）下水平静置。

2小时后观察并记录结果。

附：重吸收试验对于未致敏粒子和致敏粒子均显示±以上凝集的样品，要按照下列程序在完成吸收操作的基础上进行再试验。

1)取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子0.95ml至小试管中。

2)加入样品50μl混合，于室温（15℃-30℃）下放置20分钟以上。

3)离心分离（2000rpm、5分钟），然后分别吸取上清液【吸收完毕的稀释样品（1：20）】50μl至反应板第3孔中，特别注意不要混入粒子。

4)从第4孔以后，要预先各滴入25μl血清稀释液，从第3孔至最后一孔用移液器以2n 的方式进行稀释。

5)之后的步骤同上。

3.结果3.1结果判读首先观察未致敏粒子反应孔是否出现凝集（第3孔），判断试验有效性后，再根据致敏粒子与标本反应孔（第4孔）与致敏粒子是否产生1+ ～2+凝集反应凝集反应，判断结果。

如未致敏粒子反应孔出现凝集（第3孔）为无效试验，需要对标本进行重吸收试验后再进行检测。

++ ：产生均一的凝集，凝集粒子在底部，呈膜状延展；+ ：粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱的凝集在周围；±：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形；- ：粒子呈纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。

目的：规范的梅毒螺旋体检验操作，确保检测结果准确。

适用范围：性病实验室工作人员责任人：实验操作者1、标本的采集与处理1.1标本采集的基本要求1.1.1操作应规范化。

1.1.2所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套谨慎操作。

1.2梅毒标本采集梅毒的实验室诊断主要有病原体检测和血清学检测方法，各期梅毒的检测方法及部位见下表。

1.2.1血液1.2.1.1血清标本根据需要，用一次性真空采血针与促凝采血管抽取静脉血2-5 ml，室温静置1-2小时（或37℃静置30分钟），待血液凝固、血块收缩后，3000r/min离心10-15分钟，分离新鲜血清，备用。

也可采用保存于2-8℃或-20℃的血清。

溶血、脂血或污染的标本可影响试验结果。

1.2.1.2血浆标本根据需要，用一次性真空采血针与抗凝采血管抽取静脉血2-5 ml，轻轻颠倒混匀8-10次，3000r/min离心10-15分钟，分离血浆，备用。

血库血浆以及EDTA 抗凝血浆同样可以用于梅毒血清学实验（一般仅用于RPR实验，），但易出现假阳性反应（需用血清复试），如用其他抗凝剂应首先评价后再用。

1.2.1.3末梢全血消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择手指或耳垂，1岁以下儿童采用足跟部）。

一次性采血针刺破皮肤，用无菌棉签擦掉第一滴血。

收集滴出的血液，立即用于检测。

1.2.2皮损部位组织液1.2.2.1用于病原学检查用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片立即用于暗视野显微镜检测，或取渗出液直接涂片，用于镀银染色试验。

1.2.2.2用于核酸检测用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，刮取渗出液，加入有DNA保存液（1ml/管）的标本管中，备用。

1.2.3淋巴液无菌操作下穿刺腹股沟淋巴结，注入0.3ml无菌生理盐水并反复抽吸2-3次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片后立即进行暗视野镜检或备用。

梅毒TPPA抗体检测作业指导书1、试验原理：梅毒抗体检测是采用抗原抗体凝集反应中的抗原抗体凝集反应。

其原理如下：将梅毒(Nichols 株)的精制菌体成分包被在人载体明胶粒子上。

这种致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体（TP）抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应（Particle Agglutination Test;PA法），由此可检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体（TP）抗体，并且可用来测定抗体效价。

2、样本收集和贮存：血清或血浆1ml，标本应无溶血，无脂血，无微生物污染。

不满足上述要求的标本拒收，标本的采集应使用清洁，无菌的一次性的干燥管。

标本用量最少50ul，七天内检测的标本应在2-8℃保存，贮存在-20℃可保存4W，同时避免反复冻融血清。

3、安全防范：3．1此试剂盒内含人血成分。

尽管所有的对照及定点对照都已经过试验验证并且发现对于乙型肝炎表面抗原，丙型肝炎抗体，HIV抗体均为阴性；但仍认为它们具有潜在的感染性。

3．2移液过程禁止用口。

3．3在处理试剂和标本的地方禁止吸烟，饮食。

3．4使用试剂盒和标本时，必须戴一次性手套，穿试验服。

使用后请彻底洗手清洁。

3．5患者样本及其他潜在感染材料试验后应放入医用垃圾桶内。

3．6试剂的溶解液，血清稀释液和阳性对照血清含有叠氮钠作为防腐剂,叠氮钠可以和铅铜反应形成爆炸的金属叠氮化合物.为防止金属叠氮化合物的形成,应用大量的水冲洗以免其堆积.4、试剂：4．1 储存与稳定性：试剂应在2-10℃保存。

冻干试剂必须在复溶后的当天使用，如果保存在2-10℃最多可使用7天。

4．2 试剂盒组成：（由富士瑞士欧公司出产）（1）溶解液（液体）8mL×1瓶用于调制致敏粒子和未致敏粒子。

（2）血清稀释液29mL×1瓶用于样品的稀释。

（3）致敏粒子（冷冻干燥）调制浓度为1%的Treponema Pallidum(Nichols 株)致敏明胶粒子。

（4）未致敏粒子（冷冻干燥）经单宁酸处理调制浓度为1%的明胶粒子。

广西壮族自治区疾病预防控制中心SERODIA—TP·PA梅毒螺旋体抗体明胶凝集试验标准操作细则（日本富士，FUJIREBIO INC.）版号：第2003年版文件编号：GXCDC/Y16-13-1811、目的对SERODIA—TP·PA梅毒螺旋体抗体明胶凝集试剂使用进行必要的细化和补充，以规范本试剂的操作程序，正确使用本试剂,保证检测结果准确。

2、适用范围操作适用于采用SERODIA—TP·PA梅毒螺旋体抗体明胶凝集试剂的所有操作。

3、职责科室负责人：负责对科室综合管理。

保管人员：负责对SERODIA—TP·PA梅毒螺旋体抗体明胶凝集试剂使用操作是否符合规范，并对SERODIA—HIV明胶凝集试剂进行使用效期记录。

使用人员：负责按照本细则对SERODIA—TP·PA梅毒螺旋体抗体明胶凝集试剂使用操作，并进行使用记录。

4、工作程序（一）、原理利用纯化的致病性梅毒螺旋体（Nichol株）抗原包被明胶颗粒，此致敏的明胶颗粒将与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合产生可见的凝集反应。

本试剂有如下优点：（1）操作简便，无需特殊设备。

即可对单个标本进行检测，也可用于大规模普查。

（2）反应时间短：孵育时间仅2小时，随后肉眼观察结果。

（3）高度特异性：本试验中所用的载体为人工制造的明胶颗粒，由富士公司独创。

与其它同类试剂中所用的生物载体相比（如TPHA 中的红细胞），最大限度地降低了非特异凝集反应。

（二）、试剂盒内容“A”溶解液（Reconstituting Solution）：用于溶解致敏颗粒“C”和非致敏颗粒“D”。

“B”标本稀释液（Sample Diluent）：用于标本的稀释。

“C”致敏颗粒（Sensitized Particles）：为冻干粉，用前30分钟按规定量加“A”液溶解混匀。

是包被有梅毒螺旋体抗原的明胶颗粒。

“D”非致敏颗粒（Unsensitized Particles）：为冻干粉，用前30分钟按规定量加“A”液溶解混匀。

梅毒螺旋体抗体测定TPPA标准操作规程1 检验申请单独检验项目申请：TPPA；组合项目申请：RPR+TPPA，临床医生根据需要提出检验申请。

2 标本采集与处理2.1标本采集2.1.1常规静脉采血约2 ml，不抗凝，置普通试管中。

或采用含分离胶的真空采血管。

2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。

2.1.3标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。

专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。

2.1.8下列标本为不合格标本2.1.8.1标本量不足。

2.1.8.2严重溶血、严重浑浊的标本。

2.1.8.3无法确认标本与申请单对应关系的。

2.1.8.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。

2.2标本保存2.2.1标本保存时间：立即测定或放置2～8℃冰箱内。

2.2.2已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内保存7天。

3、方法原理凝集法。

将梅毒的精制菌体成分包被在人工载体明胶离子上.这种致敏离子和样品中的梅毒螺旋体抗体进反应发生凝集,产生粒子凝集反应,由此可以检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体抗体,并且可用来测定抗体效价。

4、试剂及其他用品准备溶解液8ml/瓶×1，血清稀释液60ml/瓶×1，致敏粒子(冷冻干燥) 0.6ml/瓶×5，未致敏粒子 (冷冻干燥) 0.6ml/瓶×5，阳性对照血清 (液状) 0.6ml/瓶×5。

5 质控品与室内质控规则5.1 质控液重建方法：液态质控血清，即开即用，无需特殊准备。

5.2 质控品测定：在每一批标本中测定阴性和阳性对照各一次。

5.3质控规则：阴性和阳性对照符合即可。

5.4如出现失控情况，按室内质控标准操作程序采取各种有效的纠正措施及时纠正，并在确认重新回复到控制状态后开始标本检测。

6操作步骤6.1将血清稀释液滴入微量反应板第1孔中，共计4滴（100ul），从第2孔至最后一孔各滴入1滴（25ul）。

梅毒螺旋抗体TPPA（凝集法）传播途径：1、性接触这是主要的传染途径。

未经治疗的病人在感染后的1年内最具有传染性；随着病期的延长，传染性越来越小；到感染后4年，通过性接触一般无传染性。

2、血传播梅毒患者、潜伏梅毒及隐性梅毒血清具传染性，通过输血及共用针头可传染他人。

3、胎传患梅毒的孕妇可以通过胎盘使胎儿受染，一般认为感染发生在妊娠4个月以后。

名称：赛乐迪亚原理：将梅毒的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上。

这种致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体（TP）抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应，由此可以检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体（TP）抗体,并且可用来测定抗体效价。

操作方法：试验前试剂应恢复到15～30℃。

用前30分钟按规定量加溶解液（0.6ML)溶解致敏颗粒、未致敏颗粒并混匀；按规定量加溶解液于质控血清。

(1)标本稀释液加至微量反应板孔内，第l孔100微升，第2-5孔各25微升。

(2)取血清或血浆25微升加至第1孔，混匀后取25微升至第2孔，混匀后取25微升至第3孔，混匀后取25微升至第4孔，混匀后取25微升至第5孔，混匀后弃去25微升。

(3)第4孔未致敏颗粒25微升，第5孔加致敏颗粒25微升。

(4)将反应板置振荡器振荡30秒。

(5)加盖后于室温（15-30℃）下水平静置，2小时后观察结果。

结果判断：判定基准阳性：未致敏粒子（最终稀释倍数１：４０）的反应图象判定为（－），致敏粒子（最终稀释倍数１：８０以上）的反应图象判定为（＋）时,最终判定为阳性，进行方法2的测定时，将显示出反应图象为(+)时的最终稀释倍数作为抗体效价。

阴性：无论未致敏粒子呈现何种反应图象，只要致敏粒子（最终稀释倍数１：８０）的反应图象显示为（－）时，最终判定即为阴性。

未致敏粒子（最终稀释倍数１：４０）的反应图象判定为（－）且致敏粒子（最终稀释倍数１：８０）的反应图象判定为（±）时，最终判定为保留。

注意事项：使用过的器具（移液管、试管等）、废液、废物等除用次氯酸钠（有效氯浓度1,000ppm，浸泡1小时以上），戊二醛（2%，浸泡1小时以上）进行消毒以外，还要进行高压蒸汽灭菌（121℃1小时以上）及焚烧等处理。

梅毒螺旋体抗体测定TPPA标准操作规程1 检验申请单独检验项目申请：TPPA组合项目申请：RPR+TPPA临床医生根据需要提岀检验申请。

2标本采集与处理标本采集常规静脉采血约2 ml，不抗凝，置普通试管中。

或采用含分离胶的真空采血管。

检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。

标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。

专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。

下列标本为不合格标本标本量不足。

严重溶血、严重浑浊的标本。

无法确认标本与申请单对应关系的。

其他如标识涂改、标本试管破裂等。

标本保存标本保存时间：立即测定或放置2〜8C冰箱内。

已完成测试的标本保持完整的识别号，置4〜8C冰箱内保存7天。

3、方法原理凝集法。

将梅毒的精制菌体成分包被在人工载体明胶离子上•这种致敏离子和样品中的梅毒螺旋体抗体进反应发生凝集，产生粒子凝集反应，由此可以检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体抗体,并且可用来测定抗体效价。

4、试剂及其他用品准备溶解液8ml/瓶x 1,血清稀释液60ml/瓶x 1，致敏粒子（冷冻干燥）瓶x 5，未致敏粒子（冷冻干燥）瓶x 5，阳性对照血清（液状）瓶x 5。

5质控品与室内质控规则质控液重建方法：液态质控血清，即开即用，无需特殊准备。

质控品测定：在每一批标本中测定阴性和阳性对照各一次。

质控规则：阴性和阳性对照符合即可。

如岀现失控情况，按室内质控标准操作程序采取各种有效的纠正措施及时纠正，并在确认重新回复到控制状态后开始标本检测。

6操作步骤将血清稀释液滴入微量反应板第1孔中，共计4滴（100ul ），从第2孔至最后一孔各滴入1滴（25ul）。

吸取样品25ul至第1孔中。

然后以2n的方式从第1孔稀释至最后一孔。

用试剂盒中提供的滴管在第3孔中滴入1滴（25ul）未致敏粒子，从第4孔至最后一孔滴入1滴（25ul）致敏粒子。

用平板混合器以不会导致微量反应板内容物溅岀的强度混合30秒钟，加盖后于室温（15-30 C）下静置，2小时后，观察结果。