中国药典内毒素检测方法

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》

——凝胶法

凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).

λc=1g-1(∑X/4) 式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法

中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布

一、 定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。

二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。

三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。

2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。

3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。

4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。

四、试验前准备

1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。

2、鲎试剂灵敏度测定

（1） 试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。

（2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。

五、试验方法

1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。

2、浸提介质:无热原水。

3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。

1 目的

规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。

2 范围

适用于本公司质管部对注射用水的细菌内毒素检验。

3 责任

检验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。

4 内容

本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

4.1仪器、用具

4.1.1天平、电热干燥箱、旋涡混合器、恒温水浴锅、反应试管、镊子（金属）、金属盒、移液器具，酒精灯、脱脂棉球、剪刀、砂轮、封口膜，记号笔。

4.1.2用具除去外源性内毒素：

将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。

4.2试剂

4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

4.2.2鲎试剂

4.3鲎试剂灵敏度复核试验

鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。

λc=lg-1(∑X/4)

式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ≤λc≤2.0λ时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。

4.4供试品干扰试验

按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的细菌内毒素溶液。用细菌内毒素检查用水制成的每一浓度平行做2支和用供试品溶液或稀释液制成的每一浓度平行做2支和用供试品溶液或其稀释液制成的每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液各做2支阴性对照管。

药品的炽灼残渣检测方法（欧洲药典、美国药典）

1 原理：药品（多为有机化合物）经高温加热分解或挥发后遗留下的不挥发无机物（多为金属的氧化物，碳酸盐，磷酸盐，硅酸盐和氯化物等）。

2 仪器与用具：高温炉、坩埚、坩埚钳、通风柜

3 试剂与试液：硫酸 分析纯

4 操作步骤

中国药典检测方法

空坩埚恒重：取坩埚置于高温炉内，将盖子斜盖在坩埚上，经700～800℃炽灼约30～60分钟，取出坩埚，稍冷片刻，移置干燥器内并盖上盖子，放冷至室温，精密称定坩埚重量。再在上述条件下炽灼约30分钟，取出，置干燥器内，放冷，称重；重复数次，直至恒重，备用。如无特殊情况，空坩埚在700～800℃（或500～600℃）炽灼二小时即可恒重。

称取供试品：取供试品～或各该药品项下规定的重量，置已炽灼至恒重的坩埚内，精密称定。

炭化：将盛有供试品的坩埚斜置电炉，炽灼至供试品全部炭化呈黑色，并不冒浓烟，放冷至室温。“炭化”操作应在通风柜内进行。

灰化：除另有规定外，滴加硫酸～，使炭化物全部湿润，继续在电炉上加热至硫酸蒸气除尽，白烟完全消失（以上操作应在通风柜内进行），将坩埚移置高温炉内，盖子斜盖于坩埚上，在700～800℃炽灼，约60分钟，使供试品完全灰化，（如供试品要做重金属试验，则灰化温度应在500～600℃）。

恒重：按操作方法5.4.4，依法操作炽灼30分钟，直至恒重。如无特殊情况，在700～800℃（或500～600℃）炽灼二小时即可恒重。 如需将残渣留作重金属检查，则炽灼温度控制在500～600℃。

5 欧洲药典检测方法

在600±50℃灼烧一个白金、瓷或石英坩埚30分钟，干燥器内冷却后称重。加入规定量的样品于上述坩埚内，称重。

用1mL的硫酸湿润样品，在低温上加热直至样品完全炭化。冷却后，用少量的硫酸湿润残渣，加热直至白烟不再产生。

在600±50℃的高温炉内灼烧，直至残渣完全灰化（在操作过程不应有火焰出现），干燥器内冷却后称重，并计算残渣的量。