抗体工程技术

抗体工程制药（单克隆抗体）抗体是由成熟B 细胞产生的。

抗体的应用：①研究：免疫荧光发检测特定抗原②查验特定病原体③医疗：带有毒素的抗杀伤特定细胞。

McAb 在免疫导向疗法中存在的问题：A 、McAb 均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA ），加速了排斥反映，在人体内的半衰期只有5-6h ，难以维持有效药物作用靶组织时刻；B 、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的医治浓度。

需要解决的问题：A 、降低McAb 的免疫源性；B 、降低McAb 的相对分子质量。

基因工程包括以下内容①基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因克隆出来，进行原核表达，挑选特异性的基因②噬菌体抗体库技术；③含人免疫球蛋白的转基因小鼠 广州地域销售抗体占全国的30%，第二是北京和上海（罗氏占绝对优势，鼠抗人CD3单抗是我国唯一品种）。

多克隆抗体：抗原注入—受体动物—产生多种B 细胞—取得多种抗原（通过那个流程咱们能够得出多克隆抗体的B 细胞是不用和骨髓瘤细胞杂交的也自然不用挑选）制备单克隆抗体的大体原理 ：制备：抗原—受体动物—致敏B 细胞+骨髓瘤细胞（PEG ）—杂交瘤（细胞培育（HAT 培育基）—阳性挑选—①体内培育②体外培育）—单克隆抗体；（杂交瘤细胞是为能再生成单抗，细胞活力高；这确实是什么缘故书上说单克隆抗体的技术原理是基于动物细胞融合技术得以实现的）（1）抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原；不需纯化；化学合成或提纯；微生物或细胞可直接作为抗原免疫动物：BALB/c 小鼠和Lou 大鼠；Balb/c 小鼠，8-12周龄；雄性；动物与骨髓瘤同品系；佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂免疫方式（Attetion:是免疫不是培育）：①体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下,腹腔注射免疫。

②体外免疫:不能用体内免疫的杂交瘤细胞株、不稳固初步免疫和增强免疫→测定抗体效价→处死小鼠,去脾细胞（2）细胞融合—骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT)缺点型）应和免疫动物属于同一品系，如此杂交率高—饲养细胞：在组织培育中，单个或少数分散的细胞不易生长繁衍，假设加入其他活细胞那么可增进这些细胞生长繁衍，所加入的细胞称饲养细胞。

经常使用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。

—用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具有融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳固等特点—PEG 浓度在10%-60%范围内的PEG 都能使细胞发生融合。

为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO ，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。

但必需严格限制接触时刻。

（3）挑选与抗体查验附：HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT ：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶激酶（TK ）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT ）。

如细胞含有此两种酶那么可启动补救（应急）途径。

次黄嘌呤,胸腺嘧啶在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作用下合成DNA 的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断．—在HA T 培育液中，骨髓瘤细胞缺乏TK 或HGPRT 而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，整体水平抗体生成技术 细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术多克隆抗体(抗血清)(Polyclonal antibody 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B 细胞增殖分化所产生的, 单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)通过B 细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体 特点:单一特异;可重复;大量供应、不需纯抗原;灵敏度高嵌合抗体、改形抗体、“小型化抗体”（单链抗体）、组合抗体库技术、噬菌体抗体库技术、Ig 基因转基因小鼠、抗体真核表达技术只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。

脾细胞（HGPRT+, TK+, 不能长期生长）；骨髓瘤细胞（HGPRT-, TK-，不能生长）；杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+，能够生长）次黄嘌呤（H）\胸苷（T）—核酸补救合成—核酸—脾细胞（不能长期增值）/杂交瘤细胞—核酸—从头合成（甲氨蝶呤（A）阻断）（4）杂交瘤的克隆化—杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。

—作用:分开抗体分泌细胞和非分泌细胞及其他抗体分泌细胞，非分泌细胞比分泌细胞生长快，可抑制分泌细胞的生长。

—方式：经常使用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

①有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。

第一次克隆化时也要应用HT培育液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培育液。

②软琼脂法：在培育液中加入%的琼脂糖凝胶，细胞割裂后形成小球样团块，由于培育基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培育。

单抗检测抗体查验：RIA、ELISA、免疫荧光技术等杂交瘤细胞的冻存；每次克隆后进行冻存（5）单克隆抗体的鉴定：特异性鉴定；类与亚类的鉴定（类:酶标或荧光素标记的IgG, IgM）；中和活性的鉴定；识别抗原表位的鉴定；亲和力的鉴定；效价鉴定杂交瘤细胞的染色体数量：接近两亲本细胞染色体数量的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应显现少数标志染色体。

染色体数量多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，那么反。

（6）培育①体外培育法：可取得10µg/ml的抗体。

采纳RPMI1640，添加10%-20%牛血清。

但由于培育液中含有血清成份，给纯化带来困难。

改良的方式有：无血清培育法、悬浮培育法、微载体悬浮培育法。

无血清培育法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。

此法虽可减少污染，但产量不高。

悬浮培育法：持续悬浮培育的细胞密度可达2*107/ml, 搜集的单克隆抗体可达400 µg/ml。

如在培育液中加入微载体，细胞密度可达108。

②动物体内诱生法：可取得10mg/ml的抗体。

大体程序：接种前1-2周，小鼠腹腔注射Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，7-12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。

优势：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保留杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。

缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。

抗体工程制药（基因工程抗体）第三节基因工程抗体(Genetic engineering antibody)概念：采纳基因工程方式，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。

要紧包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。

目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，三增加组织通透性。

一、单克隆抗体人源化(humanized antibody)；降低ＨＡＭＡ反映；人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而取得的抗体。

单克隆抗体人源化嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。

人源化程度达到70%左右杂交瘤细胞—mRNA分离—cDNA（鼠VL人CL+鼠VH人CH；轻链只能和轻链编码一个区；两个载体共转染SP2/0 VH或VL基因.为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。

改型抗体将小鼠的CDR（互补决定区）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体（通过PCR的方法克二代改型抗体：CDRs邻近处的序列在人源化方案中加以考虑；对鼠及人ＶＨ和ＶＬ表面引起强免疫原性的残基进鼠抗同源性最大的人ＩＧ为框架，进行人源化设计：(1)模板替换: (2)表面重塑(3)补偿变换(4)定位保留。

BUT亲和小分子抗体，Fab:单价VH-CH1+VL-CL由两个片断由二硫键连接;1/3;Fab与细菌的前导肽相连,入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。

它具有与抗体活性，其特点是结构稳定，制作简便(共转染)。

Fab抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入减少了非特异反应和排斥反应；无ADCC和细胞毒CDC；主要作为载体分子用于导向诊单链抗单价单链抗体（传统单链抗体Fv:VH+VLFv:是由抗体重轻链可变区基因(V H、V L)之间以非共价键结合;具有抗原结合能力的最小抗体片段;故Fv不稳定连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。

(GGGGS)3。

仅鼠源V 区，为1/ 80 ~ 1/ 3 体dsFv:VH+(s-s)+VLScFv:VH+连接肽+VLAttetion:鼠源CDR人源FRdsFv:Fv [二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]ScFv:VH+连接肽+VL;用适当寡核苷酸链编码的连接肽在具备亲本单抗可变区cDNA克隆时，可用定端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接组装到表达载体中;若从杂交瘤细胞系构建单链方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载单链抗体多聚体: linker少于１２个氨基酸，形成多聚体双特异性单链抗体VH1+linker+VL2&VH2+linker+VL1两者之间互相配对，形成的单链抗体可以同时与两种不合；可以抗体+放射性核素；抗体+药物；作为“生物导弹”用于疾病的诊断和治疗小识别单位即为VH，约为完整分子的1/12。

它只由一个结构域构成，故称单域抗体。

单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性分别由单域V H或V L采用基因工程法构建的抗体组成。

该类抗体构建简便，鉴于在抗原结合部位中，V H作用比V L大，大多数单独的V H保留了较力和专一性，单独V L抗体因只有一个功能区而没有抗原结合能力，无应用价值，因此单和应上有其优点。

由于V H暴露了原先与V L结合的疏水性，使其特异性降低，还需对V H片造才能应用单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。

产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。

优点：无HAMA反应；能维持与抗原较高结合的性能；分子量小，穿透性强（单链抗体还可以穿过血管组织定位于肿瘤），体内免疫原性低，易于穿透；但linker增加了新的抗原性或者会破坏ScFv的正确折叠。