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一株红树林内生真菌次级代谢产物中活性组分的活性跟踪法分离研究梁小莉;高俊平;潘润恺;佘志刚;肖娜娜;蔡小玲;林永成【摘要】对从广西山口红树林保护区采集的21株植物内生真菌进行了抗菌、抗肿瘤筛选,得到4株活性菌株,其中SK11菌株活性最强.采取活性跟踪方法,从SK11菌株次级代谢产物中分离到了活性成分Lichexanthone和Bikaverin,并用分子生物学方法鉴定该菌株为链格孢霉菌(Alternaria sp.).这是首次从该属中分离得到这两种化合物.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2009(026)010【总页数】5页(P48-52)【关键词】链格孢霉菌;活性跟踪法;内生真菌;次级代谢产物【作者】梁小莉;高俊平;潘润恺;佘志刚;肖娜娜;蔡小玲;林永成【作者单位】中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275;中山大学化学与化学工程学院,广东省生物功能分子重点实验室,广东,广州,510275【正文语种】中文【中图分类】Q946.8;Q949.32海洋共生微生物是指与海洋动植物宿主互利共生的海洋微生物，包括附着在海洋动植物表面(包括内腔)的微生物以及生长在海洋动植物内部(细胞间或细胞内)并与动植物存在着互惠互利或一方受益的共生或寄生关系的微生物。
近几年, 本研究组已经分离海洋真菌2000多株，活性筛选800多株，鉴定100多株；从已经发酵培养的100多株菌株中，分离次级代谢产物400个化合物，新结构化合物200多个，初步确定具有抗肿瘤、抗病毒等活性的化合物有140多个,揭示了海洋真菌具有极大的药用开发前景[1～3]。
海洋微生物产生的抗炎物质的筛选与鉴定技术研究海洋微生物是指生活在海洋中的微小生物，包括细菌、真菌、病毒等。
近年来，随着人们对海洋生物资源的逐渐认识和重视，海洋微生物产生的活性物质引起了广泛关注。
其中，海洋微生物产生的抗炎物质被认为具有广泛的生物活性和潜在的药用价值。
本文将介绍海洋微生物产生的抗炎物质的筛选与鉴定技术的研究进展。
一、海洋微生物样品的筛选与收集海洋微生物产生的抗炎物质的筛选与鉴定技术的研究首先需要获取海洋微生物样品。
目前常用的方法包括浮游生物网捕捞、海底沉积物采集、海水过滤等。
1. 浮游生物网捕捞浮游生物网捕捞是一种常用的海洋微生物样品收集方法。
通过使用特殊设计的浮游生物网，可以捕捞到不同种类的浮游生物，包括浮游植物、浮游动物和微生物等。
这种方法适用于浅海和近海地区的采集，可以获取较多数量的海洋微生物样品。
2. 海底沉积物采集海底沉积物是海洋中富含生物资源的重要存储库之一。
通过使用取样器和海底钻探等方法，可以从海底获得含有丰富微生物的沉积物样品。
海底沉积物样品的采集需要依靠专业的海洋科学研究船只和设备，较为复杂和昂贵。
3. 海水过滤海水过滤是一种简便高效的海洋微生物样品采集方法。
通过使用特制的微孔滤膜，可以过滤掉海水中的大颗粒物质，保留微小的海水中的微生物。
这种方法适用于深海和远离陆地的海域，可以获取海洋微生物的多样性样品。
二、海洋微生物样品的培养与分离获取到海洋微生物样品后，需要进行培养与分离，以获得纯种菌株或菌群。
培养与分离的方法主要包括传统的培养方法和分子生物学技术。
1. 传统的培养方法传统的培养方法是最常用的海洋微生物样品培养与分离方法之一。
该方法将海洋微生物样品分别接种到不同的培养基中，经过适当的培养条件，如温度、pH值、光照等，可使微生物在培养基上生长和繁殖。
接种后，可以通过形态、色素、生长速率等特征对菌落进行初步区分和筛选。
2. 分子生物学技术分子生物学技术在海洋微生物样品的培养与分离中起到了重要的作用。
红树林海洋细菌的分离实验材料：分离培养基1.M1培养基：可溶性淀粉0.25%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，β‐甘油磷酸钠0.01%，琼脂粉2.0%，人工海水1L，pH值7.2~7.42.2216E培养基：Yeast extract 1g，Peptone 5g，FePO4 0.01g，Agar 20g，人工海水1L，pH值7.2~7.43.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，人工海水1L，pH值7.2~7.44.称量（除琼脂外的药品）→溶化→调pH值→加入琼脂→分装→灭菌（121℃,20min）→倒平板实验步骤：1．样品处理海泥：用50ml无菌人工海水将5g左右的海泥无菌制作成均匀的悬浊液，摇床振荡0.5h(28℃,200r/min)，备用。
树根﹑树皮：分别取4g左右的树皮和树根，先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 然后进行严格的表面消毒程序，样品依次用30%的过氧化氢浸泡5 min,无菌水清洗3次, 75%酒精浸泡3min, 无菌水清洗3次, 用滤纸吸干多余的水分，在超静台将其剪成小段，研磨，然后加入到40ml无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28℃,200r/min)，备用。
2．样品稀释液的制备分别吸取500µl处理好的各种海泥、树根及树皮等样品的样液，注入盛有4.5ml，无菌人工海水的小试管中，吹吸多次，使充分混匀，然后从此小试管吸取500µl样液注入另一支盛有4.5ml无菌人工海水的小试管中，以此类推，制成10-3,10-4,10-5各种稀释度的样液。
2．细菌的分离培养吸取100µl稀释为10-3,10-4,10-5稀释度的样液涂布在M1培养基、2216E培养基、牛肉膏蛋白胨培养基用于分离细菌，并注明稀释度。
放于培养箱倒置培养，28℃,2~3d。
3．记录分离到的单菌落。
红树林海洋放线菌的分离实验材料：分离培养基1．改良高氏1号琼脂培养基可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂20g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1000ml，pH7.2～7.4，121℃灭菌30分钟。
抗白色念珠菌海洋真菌的筛选及抑菌活性初探王勇勇;蒙春蕾;蔡爽;黄敏;孟庆恒;孙建华【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2015(034)002【摘要】实验以白色念珠菌为对象,对从渤海湾不同站位分离获得的55株海洋丝状真菌进行了抗真菌活性菌株的筛选.从中筛选得到了BH431、BH515、BH531和BH09721 4株抑菌活性较高的菌株,并进一步对不同浓度发酵液的抑菌活性及代谢物性质进行了检测.结果显示,4株海洋真菌对野生型白色念珠菌SC5314均具有较强抑菌活性,其最小抑菌浓度分别为65 g/mL、19 g/mL、54 g/mL、23 g/mL;其中BH431和BH515菌株还显示出对基因敲除型菌株RM1000的抑菌活性,最小抑菌浓度分别为32 g/mL、39 g/mL.4株海洋真菌所产生的活性代谢物具有较好的酸碱适应性,活性物质分子质量＜6 000 u;其中BH431菌株的活性代谢物还具有良好的热稳定性.【总页数】5页(P55-59)【作者】王勇勇;蒙春蕾;蔡爽;黄敏;孟庆恒;孙建华【作者单位】天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387【正文语种】中文【中图分类】Q939.9【相关文献】1.北极海洋沉积物可培养细菌多样性及抗植物病原真菌活性菌株筛选 [J], 赵惠娅;方海霞;王燕;刘同军;林学政2.抗黄瓜枯萎病原真菌海洋链霉菌的筛选及其多样性分析 [J], 王皓;刘秋;姜勇;郝峰;李艳;王会岩3.广西红树林海洋微生物的分离及抗白色念珠菌的快速筛选 [J], 洪亮;杨建;解修超;陈绍兴;林丽飞4.抗农业病害真菌的海洋细菌筛选·发酵及分离初步研究 [J], 曲均革;余诚成;陈月新5.涠洲岛珊瑚礁海洋真菌的分离鉴定及其抗MR S A活性筛选 [J], 卢护木;詹振宇;李蜜;罗双宇;高程海;罗小卫;刘永宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
海洋真菌菌种的筛选及其抗菌活性研究在海洋生态系统中，真菌是一类丰富多样的微生物。
它们生存在水体中，也可以从沉积物、植物和动物体表分离出来。
近年来，研究人员对海洋真菌进行了广泛的研究，并发现了它们在抗菌活性等方面的潜力。
本文将介绍海洋真菌菌种的筛选方法，并探讨其抗菌活性的研究。
一、海洋真菌菌种的筛选方法海洋真菌的筛选是首要的步骤，它决定了后续的研究方向和进一步的实验。
以下是一些用于海洋真菌菌种筛选的常用方法：1. 采集海洋样品：海洋样品可以来自各个深度、不同类型的海域，如海洋底栖生物、沉积物、海草、海藻等。
样品采集后需立即进行处理，避免细菌和其他真菌的污染。
2. 分离真菌：将采集的海洋样品进行稀释，然后在适当的培养基上进行分离培养。
通过孢子悬滴法或划线法，得到单菌落的纯培养株。
3. 保存纯培养株：将分离得到的纯培养株保存在液氮中或以其他冻干方法保存，以备后续的实验使用。
4. 分子鉴定：确定真菌属和种的鉴定，可通过16S rRNA或ITS等序列进行分析。
这将为后续实验提供更多的信息。
二、海洋真菌的抗菌活性研究海洋真菌具有多样化的活性化合物，其中包括抗菌活性的物质。
以下是一些用于海洋真菌抗菌活性研究的主要方法：1. 抗菌活性筛选：将分离得到的海洋真菌进行抗菌活性的筛选。
常用的筛选方法包括纸片扩散法、井板法和微量稀释法。
通过与不同类型的细菌或真菌接触，观察抑菌圈的直径或最低抑菌浓度。
2. 提取活性物质：从具有抗菌活性的真菌培养物中提取活性物质。
通常使用有机溶剂如乙醚、甲醇和乙醇进行提取，并通过旋蒸或冷冻离心等方法得到纯化的提取物。
3. 结构鉴定：通过质谱和核磁共振等技术对提取物进行结构鉴定。
这将帮助确定活性物质的种类和结构，为后续的活性机制研究提供依据。
4. 抗菌机制研究：通过了解活性物质与靶菌之间的相互作用方式，探究海洋真菌的抗菌机制。
常见的研究方法包括荧光染料技术、细胞膜通透性测定和蛋白质表达分析等。
文章编号：1001－4829（2012）01－0140－04收稿日期：2011－07－12基金项目：863海洋生物技术主题项目资助（2004AA628040）；科技部社会公益项目资助（2004DIB3J072）作者简介：洪亮（1982－），讲师，从事微生物研究，E-mail ：leo-hong82@126．com ，*为通讯作者，E-mail ：yj _biology2@126．com 。
广西红树林海洋微生物的分离及抗白色念珠菌的快速筛选洪亮1，杨建1*，解修超2，陈绍兴1，林丽飞1（1．红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661100；2．陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723000）摘要：利用一种基于96孔板的快速筛选抗白色念珠菌活性的美蓝—酶标仪检测法对从广西山口、防城、北海三个地点红树林分离的498株细菌，299株真菌进行活性检测。
结果表明，157株细菌具有抗白色念珠菌活性，占总分离细菌数的31．5%，88株真菌具有抗白色念珠菌活性，占总分离真菌数的29．4%。
且抗白色念珠菌活性菌株的比例与样品来源密切相关。
关键词：红树林；海洋微生物；抗白色念珠菌；美蓝—酶标仪检测法中图分类号：S682．32文献标识码：AIsolation of Marine Microorganism from Guangxi Mangroveand Rapid Screening for Activity against Candida albicansHONG Liang 1，YANG Jian 1*，XIE Xiu-chao 2，CHEN Shao-xing 1，LIN Li-fei 1（1．College of Life Sciences and Technology ，Honghe University ，Yunnan Mengzi 661100，China ；2．Shanxi Key Laboratory of Resource Biol-ogy ，Shanxi University of Technology ，Yunnan Hanzhong 723001，China ）Abstract ：Methylene blue-microELISA spectrophotomer detection method was used for detecting activity against C．albicans based on 96-well plate and marine microorganisms were isolated from Guangxi mangrove in Shankou ，Fangcheng ，Beihai．The result showed that 157out of 498isolates showed activity against C．albicans ，which was 31．5%of the total bacteria isolates．Eighty-eight out of 299strains of fungi iso-lates showed activity against C．albicans ，which was 29．4%of the total fungi isolates．The proportion of anti-Candida albicans active strains was closely correlated with sample collections．Key words ：Mangrove ；Marine microorganism ；Anti-Candida albicans ；Methylene blue-microELISA spectrophotomer detection method近年来，随着免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、广谱抗生素应用的增多，深部真菌感染发病率日益增高，感染菌种也多种多样，造成全身系统，各器官组织感染，对免疫受损人群，尤其对艾滋病、白血病、恶性肿瘤患者的生命构成严重威胁［1］。
因此有效控制深部真菌病具有重要的临床意义。
目前，临床上用于抗真菌的药物除两性霉素B 之外，主要有唑类，烯丙酰胺类等化学合成药物。
而这些抗真菌药物毒副作用较强，且对曲霉和侧孢菌感染的疗效不理想，另一方面随着抗真菌药物的大量应用，真菌耐药性不断出现，使真菌感染的治疗变得越来越困难［2］。
因此，新型抗真菌药物的研究和开发，日益受到重视。
红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落，一般生长在海岸及河口潮间带泥地里，具有十分独特的生理和生态特征，水分高、盐分高、氧气缺乏。
红树林生态系统是地球上生产力最高的海洋四大自然生态系统之一［3］。
由于红树林生境有着不同于海洋和陆地的性质，其地下部分微生物的生态系统较之其他环境有很大的不同，赋予了红树林微生物产生不同于其他生态系统的活性物质的潜在可能性，同时还具有环境修复功能，包括修复农药污染、修复有机污染物污染、修复农产品重金属污染等等。
因此，近年来对红树林生境微生物的研究已引起人们的关注［4 7］。
然而研究开发海洋药物的过程中，建立标准化的行之有效的活性检测方法无疑是发现新的活性化合物的关键：特别是在初筛阶段，灵敏、快捷、用量少且相关性好的活性筛选模型是提高筛选成功率的保41西南农业学报Southwest China Journal of Agricultural Sciences 2012年25卷1期Vol.25No.1证［8］。
本研究采用一种快速、准确、方便、价格经济的美蓝—酶标仪检测法进行大通量的抗酵母类真菌活性筛选。
1材料与方法1．1材料1．1．1检测菌白色念珠菌（Candida albicansATCC 10231）由中国热带农业科学院生物技术研究所提供。
1．1．2培养基M1培养基、Martin 培养基［5］、黄豆粉培养基［9］、YPD 培养基［10］。
1．1．3染料吕氏碱性美蓝。
1．2方法1．2．1采样在广西省防城、北海、山口三个红树林保护区采集红树植物和半红树植物的土壤、根、果实、叶等共55个样品。
1．2．2样品预处理土壤样品：称取5g 样品，在无菌条件下加入盛有45mL 50%无菌陈海水的三角瓶中，用涡漩震荡器充分震荡均匀后，于28ħ，200r /min 摇床振荡0．5h ，制成10－1稀释液，依此类推制成10－4、10－5、10－6稀释液，备用。
根、果实、叶样品分别称取5g ，用自来水冲洗干净，然后用75%酒精浸泡1 2min ，再用无菌水冲洗，在无菌操作下剪碎，研磨，然后分别加入到45mL 50%无菌陈海水中，用涡漩震荡器充分震荡均匀后，于28ħ，200r /min 摇床振荡0．5h ，备用。
1．2．3菌株分离、纯化和保藏取100μl 处理液直接涂布于M1和Martin 培养基，28ħ培养。
根据菌落在平板上的形态特征，从平板挑取细菌和真菌，分别用M1培养基和Martin 培养基进行纯化，制成含20%甘油的溶液，－20ħ保藏。
1．2．4发酵将从M1培养基、Martin 培养基分离出的菌株分别接种到黄豆粉发酵培养基中，28ħ，200r /min 下摇床发酵，细菌发酵3 4d ，真菌发酵5 7d 。
发酵液离心，经0．22μm 孔径混合纤维树脂微孔滤膜过滤获得无细胞发酵上清液，备用。
1．2．5活性检测将培养17h 的白色念珠菌用YPD 培养基稀释至1 5ˑ105CFU /mL ，在无菌96孔板上，三孔只加入YPD 培养基200μl 作为空白对照，另三孔每孔中均加入稀释好的菌液100μl 和YPD 培养基100μl 作为白色念珠菌正常生长对照，其余各孔中都加入稀释好的菌液100μl 和无菌待测样液100μl 。
将96孔板摇床培养24h （28ħ，200r /min ）后放入酶标仪，在630nm 下测定各孔的吸光值，记录数值为A 0。
再向每孔中加入吕氏碱性美蓝20μl ，使其终浓度为0．05ɢ，室温下静置保温10min ，放入酶标仪在630nm 测定各孔的吸光值，以光吸收值＞1视为有活性［10］。
2结果与分析2．1海洋微生物的分离及活性测定红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落，生长在海陆交界的潮间带地区，形成特殊的生态环境，赋予了红树林微生物产生有活性物质的潜在可能性。
从不同样品中所得到的菌株总数、活性菌株数量如表1，从55个样品中分离得到797株海洋微生物，其中具有抗白色念珠菌活性的菌株共245株，分离到的微生物活性菌株比率为30．74%。
各个样品分离到的微生物数量差异性很大，分离到较多微生物的样品主要有红树植物的泥样和根样；由不同样品分离到的活性菌株数目以及活性菌株比率差异性也很大，活性菌株比率较高的样品有05号秋茄树根、52号桐花树树根和54号秋茄的根际土等等，在以后的采样过程中可以有选择性得采集这些样品。
表1不同样品分离到的微生物数量及活性菌株数目Table 1The number of microorganism and active strains isolated from different samples1411期洪亮等：广西红树林海洋微生物的分离及抗白色念珠菌的快速筛选2．2广西山口、防城、北海3个采样地点活性检测结果本研究采用美蓝—酶标仪检测法进行抗白色念珠菌活性的快速筛选。
对广西山口、防城、北海3个地点红树林采集到的55个样品分离出的总共797株菌进行活性检测，其中细菌498株，真菌299株。
表2结果表明，从广西山口、防城、北海3个采样地点分离出的细菌以及真菌的抗白色念珠菌活性比率存在差异，其中以北海红树林分离出的细菌抗白色念珠菌活性比率最高，其次为山口，防城。
同样也是以北海红树林分离出的真菌抗白色念珠菌活性比率最高，其次为防城，山口。
2．3微生物群体培养物活性检测对样品不进行微生物分离而直接作发酵剂接种到发酵培养基进行发酵，取发酵液进行抗白色念珠菌活性检测。
同从样品中分离出的微生物发酵液活性检测的结果（表3）来看，有些样品如60号样品直接发酵有活性的，但从该样品中分离出的微生物并没有活性。
说明这些样品的生物活性可能是由微生物的群体作用产生的，也可能是某种没有培养出的微生物产生的。
初步表明了探索微生物混合培养获得生物活性代谢产物的可能性。
表2广西山口、防城、北海3个采样地点的活性菌株比率Table 2The active strains rate of Guangxi Shankou ，Fangcheng ，Beihai采样地Sampling sites 细菌Bacteria真菌Fungi分离菌株数Number of isolates活性菌株数Number of active strains活性比率（%）Active strains ratio分离菌株数Number of isolates活性菌株数Number of active strains活性比率（%）Active strains ratio山口1595132．08378．4防城1352619．2932122．6北海2048039．21236048．8合计49815731．52998829．4241西南农业学报25卷表3微生物群体培养物活性检测结果Table3The result of bioactivity detection of nature microbial consortium采样地Sampling sites样品编号Sample No．山口08，12，14防城29，32北海43，52，58，59，603讨论本研究采用了一种新的廉价的适用于大批量筛选抗酵母类真菌活性物质的方法：美蓝—酶标仪检测法。
