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小鼠模型在甲状腺癌研究中的应用进展郑永胜【摘要】Thyroid cancer is the most common malignant thyroid tumor. In recent years,the incidence of thyroid cancer is in an uptrend year by year in China. The experiments on mice have played an important role in studying the occurrence, development and drug therapy of thyroid cancer. Presently the major mouse model being used in studying thyroid cancer includes spontaneous, suppressive, genetic, transplanted and restricted mouse model reported recently activating or inactivating genes at a particular time and tissue.%甲状腺癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤,我国近年甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势.小鼠动物模型在研究甲状腺癌的发生、发展及药物治疗中发挥着重要作用,目前用于甲状腺癌研究的主要小鼠模型包括自发性小鼠模型、诱发性小鼠模型、基因工程小鼠模型、移植性小鼠模型和最新报道的在特定时间和特定组织激活或灭活靶基因的限制性小鼠模型.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2012(018)013【总页数】4页(P2016-2019)【关键词】甲状腺癌;小鼠模型;动物实验【作者】郑永胜【作者单位】福建医科大学第一临床医学院,厦门大学附属第一医院普外科,福建,厦门,361003【正文语种】中文【中图分类】R736.1甲状腺癌占所有实体肿瘤的1%，是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，也是近年发生率上升最快的恶性肿瘤之一［1］。
HEREDITAS (Beijing)2008年7月, 30(7): 821―830 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期: 2007−12−04; 修回日期: 2008−02−15基金项目:国家自然科学基金项目(编号: 30370773)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30370773)]作者简介:王勇(1965−), 男, 浙江人, 副研究员, 博士研究生, 研究方向: 昆虫生物信息学。
E-mail: ywang@姚勤(1961−), 女, 安徽人, 研究员, 研究方向: 昆虫病毒分子生物学。
E-mail: yaoqin@ 王勇、姚勤同为第一作者。
通讯作者:陈克平(1962−), 男, 安徽人, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方向: 昆虫分子生物学、昆虫生物信息学。
E-mail: kpchen@DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00821bHLH 转录因子家族研究进展王勇1, 陈克平2, 姚勤21 江苏大学食品与生物工程学院, 镇江 212013;2 江苏大学生命科学研究院, 镇江 212013摘要: bHLH 转录因子在真核生物生长发育调控中具有重要作用, 它们组成了转录因子的一个大家族。
已经有20种生物基因组中bHLH 家族的成员得到鉴定, 其中动物17种、植物2种、酵母1种。
动物bHLH 因其调控基因表达的功能不同而被分成45个家族; 此外, 根据它们所作用DNA 元件和自身结构特点又被分成6个组。
A 组包含22个家族, 主要调控神经细胞生成、肌细胞生成和中胚层形成; B 组包含12个家族, 主要调控细胞增殖与分化、固醇代谢与脂肪细胞形成以及葡萄糖响应基因的表达; C 组包含7个家族, 主要负责调控中线与气管发育和昼夜节律、激活环境毒素响应基因的转录; D 组只有1个家族, 它与A 组bHLH 蛋白形成无活性的异源二聚体; E 组有2个家族, 调控胚胎分节、体节形成与器官发生等; F 组也只有1个家族, 调控头部发育、嗅觉神经元生成等。
小鼠neutrophil的marker基因1. 引言1.1 背景介绍小鼠neutrophil是一种重要的免疫细胞，起着关键的抗感染和抗炎作用。
在免疫系统中，neutrophil是最常见和数量最多的白细胞类型，占据着免疫反应中的重要地位。
neutrophil的功能主要包括吞噬和杀死病原微生物、释放细胞毒素和产生炎症介质等。
研究小鼠neutrophil的marker基因是非常重要的，可以帮助我们更好地理解neutrophil的生物学特性及其在免疫调节和疾病发生发展中的作用。
目前，研究人员已经鉴定出了一系列在小鼠neutrophil中高度表达的特异性marker基因，这些基因的存在可以作为鉴别neutrophil 细胞的标志。
通过对这些marker基因的研究，可以更准确地检测和定量neutrophil细胞，为进一步研究neutrophil的功能和机制提供重要的工具和依据。
对小鼠neutrophil的marker基因进行深入研究具有重要的科学意义和应用前景。
【字数：229】1.2 研究意义In summary, the study of marker genes specific to mouse neutrophils is important for advancing our understanding of immune responses and disease pathogenesis. This research has the potential to drive the development of new diagnostic andtherapeutic approaches for conditions involving neutrophil dysfunction, ultimately benefiting human health.1.3 研究目的本研究的目的是探究小鼠neutrophil的marker基因在免疫应答中的作用机制，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。
2012年3月第36卷第2期H22荷瘤小鼠是接种4×107个/mL H22肿瘤腹水癌细胞后，淘汰出瘤不佳及畸形小鼠，得到正规的荷瘤小鼠。
目前多利用基因芯片技术结合H22荷瘤小鼠研究中医证候。
伴随着人们对疾病的认识从整体、组织到细胞再到基因的逐渐深入，基因组学研究成果将对认识及治疗疾病发挥越来越大的作用。
中医的病与证有其内在的本质联系［1］，而基因的内部改变和疾病的转归也有着内在的本质联系。
利用基因组学的研究来阐释中医证候，找出两者之间的内部联系，从而使中医证候从微观指标中量化。
本文对近几年H22荷瘤小鼠证候基因研究情况作一综述。
1证候与基因组学的相关概念证候是机体在疾病发展过程中的某一阶段或某一类型的病理概括。
包括病变的部位、原因、性质，以及正邪消长变化，反映疾病发展过程中某一阶段或某一类型病理变化的本质，指导着中医学对疾病表现及其发生的认识，是中医学认识疾病和辨证论治的主要依据。
基因组学是关于基因、基因功能以及相关技术的研究。
中医证候的基因组学研究，是指在证候理论指导下，运用功能基因组学方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证时基因的变异及差异表达情况，揭示与某一证候形成相关的所有基因及其功能，从整体基因表达的水平阐明证候的本质。
既往研究发现证候与下丘脑-垂体-内分泌轴的功能紊乱有关。
H22荷瘤小鼠在肿瘤的发生与发展过程中，与人类类似，存在证候的自然发生与演变，早期以邪毒壅盛、气虚为主，以后过渡到中期、中晚期的阳气虚、气阴阳虚的复合证［2］。
因此，检测荷瘤小鼠常见不同证候下丘脑-垂体-内分泌轴基因表达谱的改变，有助于揭示肿瘤常见证候的内在分子机制。
2H22荷瘤小鼠证候的基因组学研究关于H22荷瘤小鼠证候的研究，上海中医药大学方肇勤课题组做了许多相关工作。
研究利用实验动物昆明种雄性小鼠，采用荷瘤小鼠标准化四诊及辨证方法，分别于接种肿瘤后第7天（早期）、第20天（中期）、第28天（中晚期）进行全体小鼠四诊检测与辨证，并分别于检测后的次日筛选早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证等4个证候最典型小鼠，取下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏和肿瘤组织，采用Trizol 和RNeasy Mini Kit 及其方法分离和纯化RNA ，GeneChip Mouse Exon 1．0ST Array 计算核心基因表达读数值，检测H22荷瘤小鼠的相关基因变化与证候的关系［2-4］。
小鼠IL-2基因的RT-PCR克隆作者：唐微，景冬梅，董兰，等来源：《湖北农业科学》 2013年第14期唐微１，景冬梅２，董兰２，李莉２，王娜２，曾海２（１．湖北医药学院附属太和医院生命科学研究所，湖北十堰４４２０００；２．郧阳医学院第一临床学院，湖北十堰４４２０００）摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中小鼠的ＩＬ－２ｃＤＮＡ序列设计引物，从小鼠肝脏组织中提取总ＲＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出小鼠的ＩＬ－２基因。
结果表明，克隆出了ＩＬ－２基因，获得了与预期大小相一致的８５０ｂｐ的ＤＮＡ片段，为研究其组成、结构和利用基因工程生产该药物打下基础。
关键词：小鼠；白细胞介素２（ＩＬ－２）基因；反转录中图分类号：Ｑ９５８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０13）14－3367-03CloningofMiceIL-2GeneThroughRT-PCRMethodＴＡＮＧＷｅｉ１，ＪＩＮＧＤｏｎｇ－ｍｅｉ２，ＤＯＮＧＬａｎ２，ＬＩＬｉ２，ＷＡＮＧNａ２，ＺＥＮＧＨａｉ２（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＴａｉｈｅＨｏｓｐｉｔａｌAｆｆｉｌｉａｔｅｄtoＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｉｙａｎ４４２０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ２．ＴｈｅＦｉｒｓｔＣｌｉｎｉｃＳｃｈｏｏｌｏｆＹｕｎｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｉｙａｎ４４２０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｍｉｃｅＩＬ－２ｇｅｎｅｗasｃｌｏｎｅｄfromｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｍｉｃｅｌｉｖｅｒｂｙＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＩＬ－２ｃＤＮＡsequenceinGenBank．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＩＬ－２ｇｅｎｅｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｌｏｎｅｄwiththeexpectedsizeof850bp．Ｉｔｓｅｔａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｒｕｇｏｆＩＬ－２ｇｅｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｏｕｓｅ；ＩＬ－２ｇｅｎｅ；ＲＴ－ＰＣＲ白细胞介素２（Iｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２，ＩＬ－２）是由ＣＤ４＋Ｔ细胞在受促有丝分裂素或异源物刺激后分泌的一种１５ｋu蛋白，具有广泛生物学活性的细胞因子。
小鼠淋巴细胞hprt基因突变检测的研究进展杨录军;曹佳【摘要】肿瘤的发生、发展与突变事件密切相关.人类在环境中接触的突变剂的检出依赖于致突变试验.以次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, hprt)基因为报告基因的 hprt突变试验是几个重要的致突变试验之一,其优点在于不仅能检测出突变剂的致突变能力大小,还可以对突变体进行突变谱分析,并且能为多种与 hprt基因突变相关的人类疾病提供研究资料.以小鼠啮齿动物为试验模型的淋巴细胞 hprt基因突变试验近年来得到广泛应用,本文对其研究进展作一综述.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2006(018)005【总页数】3页(P414-416)【关键词】hprt;突变;突变谱;淋巴细胞【作者】杨录军;曹佳【作者单位】第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】Q754次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosy1transferase,hprt)基因突变试验是几个重要的致突变试验之一。
hprt基因编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶,催化次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸反应,生成相应的核苷-5-单磷酸(NMP)。
这是一条生成NMP的补充途径。
如果存在6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、6-巯基嘌呤(6-MP)、8-氮鸟嘌呤(8-AG)等碱基类似物,则以这些物质为底物可生成相应的NMP,参与DNA合成而导致细胞死亡。
如果突变剂使hprt基因失活(hprt-）将导致细胞中的HPRT酶活性大幅度下降从而使(hprt-）细胞能在一定的嘌呤类似物浓度下正常生长而这个浓度足以导致HPRT 酶水平正常的细胞(hprt+)发生死亡。
2021年4月第29卷㊀第2期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICAApril 2021Vol.29㊀No.2李丹,蔡方舟,李哲,等.病毒性皮肤疣小鼠模型的建立[J].中国实验动物学报,2021,29(2):204-209.Li D,Cai FZ,Li Z,et al.Development of a mouse model of papillomavirus-mediated skin wart [J].Acta Lab Anim Sci Sin,2021,29(2):204-209.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2021.02.010[基金项目]中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M -1-019),艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项(2017ZX10304402-001-022)㊂Funded by CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(2016-I2M -1-019),the National Megaproject of China for Major Infectious Diseases (2017ZX10304402-001-022)㊂[作者简介]李丹(1988 ),女,博士,助理研究员,专业:预防兽医学㊂Email:lidan@ [通信作者]王卫(1981 ),副研究员,硕士生导师,研究方向:病原生物学㊂Email:wangw@病毒性皮肤疣小鼠模型的建立李丹,蔡方舟,李哲,王卫∗(北京协和医学院比较医学中心,中国医学科学院医学实验动物研究所,新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京㊀100021)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀疣是因人乳头瘤病毒(HPV)感染导致的皮肤科疾病之一,常表现为寻常疣㊁尖锐湿疣等症状,治疗后易复发,目前尚无有效的小鼠模型㊂为研究皮肤疣的防治策略及产品,本研究拟建立病毒性皮肤疣小鼠模型㊂方法㊀免疫缺陷小鼠麻醉后,利用刀片轻轻刮擦小鼠尾部皮肤制造轻微创口,接种1.5ˑ108copies 小鼠乳头瘤病毒,定期观察尾部皮肤变化,使用不同方法检测病毒DNA㊁病毒载量及病理分析㊂结果㊀MmuPV1感染小鼠尾部皮肤16周后,肉眼可见乳头瘤状增生,伴有过度角化以及表面粗糙;HE 染色分析为皮肤表面鳞状上皮增生,棘层和颗粒层有空泡变性,可原位检测MmuPV1E4RNA 转录本㊂增生部位也可检测到MmuPV1DNA 以及病毒载量㊂结论㊀本研究利用小鼠乳头瘤病毒MmuPV1感染免疫缺陷小鼠尾部皮肤,成功建立病毒性皮肤疣小鼠模型,支撑皮肤型HPV 感染㊁致病机制等研究㊂ʌ关键词ɔ㊀皮肤疣;人乳头瘤病毒(HPV);小鼠;动物模型;小鼠乳头瘤病毒ʌ中图分类号ɔQ95-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1005-4847(2021)02-0204-06Development of a mouse model of papillomavirus-mediated skin wartLI Dan,CAI Fangzhou,LI Zhe,WANG Wei ∗(Institute of Laboratory Animal Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS).Comparative Medicine Center,Peking Union Medical College (PUMC).Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Reemerging Infectious Diseases.NHC Key Laboratory of HumanDisease Comparative Medicine,Beijing 100021,China)Corresponding author:WANG Wei.E-mail:wangw@ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀Verruca is a dermatological disease caused by human papillomavirus (HPV),andincludes conditions such as verruca vulgaris and condyloma acuminatum.Although treatments are available to remove skin warts,effective therapies are still lacking.Because of species specificity,the development of animal models of HPVinfection has been limited.In this study,mouse papillomavirus (MmuPV1)was used to infect immunodeficient mice to establish a murine model of skin papillomatous hyperplasia.Methods ㊀After anesthesia,the tail skin was gently scraped with a blade to produce a slight wound,which was then inoculated with 1.5ˑ108copies of viral DNA.Changes in the tail skin were observed,viral DNA and load were examined,and pathological analysis was performed.Results ㊀Sixteen weeks post-infection with MmuPV1,papillomatous hyperplasia with hyperkeratosis had developed at the infection sites.HE staining showed hyperplasia of squamous epithelium and vacuolar degeneration in the spinous and granular layers.MmuPV1E4transcript was detected by RNAscope in situ hybridization.MmuPV1DNA in the samples was detected by PCRamplification of the E2gene.Viral DNA was tested in all MmuPV1-infected NU/NU mice samples by qRT-PCR. Conclusions㊀Our result suggest that MmuPV1skin infection in mice mimics HPV disease,and can therefore serve as a useful model for studying the pathogenesis and natural history of HPV infection.ʌKeywordsɔ㊀skin wart;HPV;mouse;animal model;MmuPV1Conflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.㊀㊀人乳头瘤病毒(human papillomavirs,HPV)可引起多种常见皮肤疾病,包括良性疣㊁光化性角化病及鳞状细胞癌等[1-2],其中免疫抑制患者感染发病并进展为癌症比免疫健全的人高100倍[3]㊂由于乳头瘤病毒具有严格种属特异性,HPV无法感染实验动物建立动物模型㊂科学家们通过犬口腔乳头瘤病毒(canine oral papillomavirus,COPV/CPV1)㊁棉尾兔乳头瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus, CRPV)㊁及兔口腔乳头瘤病毒(rabbit oral papillomavirus,ROPV)以及牛乳头瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)等感染动物模型来理解乳头瘤病毒感染过程及发病机制[4-5],然而这些感染模型个体差异大及有限的技术等问题,使得更为理想的感染实验室小鼠模型尚待建立㊂2011年,印度科学家从NMRI-Foxn1(Nu)/Foxn1(Nu)裸鼠上分离得到小鼠乳头瘤病毒(mouse papillomavirus,MmuPV1),其可感染实验室小鼠品系,首次提供利用小鼠研究乳头瘤状病毒的机会[6-9]㊂本研究利用MmuPV1感染T细胞缺陷的Crl:NU-Foxn1nu小鼠尾部并进展为病毒性皮肤疣模型,为进一步研究HPV持续感染㊁致病机制研究等提供研究平台,有望助力于HPV致病机制和治疗方法研究㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀实验动物15只6~8周龄SPF级雌性NU/NU(Crl:NU-Foxn1nu,编号403)小鼠,体重18~25g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司ʌSCXK(京)2016 -006ɔ㊂动物饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-2级实验室ʌSYXK(京)2019-0014ɔ,饲养条件:温度20~26ħ,湿度40%~ 70%,光照周期12h/12h,动物自由采食和饮水㊂本动物实验已通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会审批(批准号: WW19001)㊂1.1.2㊀病毒毒株小鼠乳头瘤病毒(MmuPV1)及质粒pMusPV由宾夕法尼亚州立大学Jiafen Hu教授惠赠㊂1.1.3㊀主要试剂与仪器三溴乙醇(Sigma-Aldrich,T48402),DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,69506),QuantiTect Probe PCR Kits(Qiagen,204343),RNAscope Probe-V-MusPV-E4(Advanced Cell Diagnostic,473281), RNAscope 2.5HD reagent kit-Brown(Advanced Cell Diagnostic,322300);Platinum TM Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen,11304029),Trans2K Plus DNA Marker(全式金,中国)㊂Bead Ruptor Elite多功能生物样品均质器(OMNI International,美国),PCR仪(Bio-Rad T100 Thermal Cycler,美国),实时定量PCR仪(Applied Biosystems Quantudio3,美国),NanoZoomer S60数字切片扫描仪(HAMAMATSU,日本)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀病毒制备MmuPV1是从小鼠尾部病变部位分离[9]㊂具体步骤为利用手术刀片将增生组织置于匀浆管中,加入PBS,电动匀浆器5.65m/s45s,间隔30s后再次匀浆,将匀浆后的产物以10000rpm离心2min,上清液置于EP管中-80ħ储存㊂MmuPV1病毒液与PBS按1ʒ5进行稀释(即40μL病毒液加入200μL PBS),混合后置于0.22μm醋酸纤维素无菌离心过滤管,过滤管中再加入200μL PBS,因过滤过程的损失,最终可得到250μL病毒液㊂1.2.2㊀小鼠感染NU/NU小鼠经三溴乙醇麻醉,按每公斤体重腹腔注射240mg㊂待小鼠麻醉后,利用刀片在小鼠尾部反复轻轻刮擦20次左右,取10μL病毒液(1.5ˑ108copies vrial DNA)滴加到刮擦过的尾部,待病毒液体自然干燥后,将感染后的小鼠放回鼠笼㊂感染后16周安乐小鼠并收集增生组织㊂1.2.3㊀MmuPV1DNA及载量检测利用Dneasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)提取病毒或动物组织DNA㊂使用MmuPV1E2上下游引物,MmuPV1_E2_1(5 -GCCCGAAGACAACACC GCCACG-3 )和MmuPV1_E2_2(5 -CCTCCGCCTCGTCCCCAAAAAATGG-3 )扩增[10],PCR反应体系为25μL,具体为:10ˑHigh Fidelity PCR Buffer 2.5μL㊁10mmol/L dNTP Mix0.5μL㊁50mmol/L MgSO41μL㊁MmuPV1_E2_1primer1μL㊁MmuPV1_ E2_2primer1μL㊁MmuPV1DNA3μL㊁Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity0.1μL㊁去离子水15.9μL㊂反应条件:94ħ10min;94ħ15s㊁60ħ30s,68ħ45s,35个循环;68ħ10min,琼脂糖凝胶电泳鉴定㊂qRT-PCR法检测病毒载量,利用已知浓度pMusPV质粒绘制标准曲线,同样靶向MmuPV1_E2基因进行检测,上下游引物同PCR扩增引物,探针序列为FAM-TGCCCTTTCAGTGGGTTGAGGACAG-MGB[10]㊂反应体系为20μL,具体为:2ˑQuantiTect Probe PCR Master Mix10μL㊁MmuPV1_E2_1primer 1μL㊁MmuPV1_E2_2primer1μL㊁MmuPV1_E2_ probe0.5μL㊁Template DNA1μL㊁Rnase-free water 6.5μL㊂反应条件:50ħ2min;95ħ10min;95ħ15s;60ħ1min,40个循环㊂1.2.4㊀免疫组化感染16周后,将MmuPV1感染NU/NU小鼠进行安乐,采集尾部增生部位皮肤,制备成石蜡块进行苏木精-伊红(HE染色)㊂方法简述:增生组织经10%的多聚甲醛固定㊁脱水透明后,石蜡包埋后切片;切片脱蜡后进行HE染色,显微镜下观察㊂1.2.5㊀RNA原位杂交制备的石蜡切片,利用RNAscope检测[11]㊂具体为:(1)切片脱蜡:60ħ烤片1h,二甲苯脱蜡, 100%酒精,室温静置干燥5min;(2)双氧水靶标修复:滴加5~8滴RNAscope 双氧水后孵育10min,蒸馏水清洗,浸没于煮沸的1ˑRNAscope 靶标修复液中放置15min,蒸馏水清洗,100%乙醇中清洗,室温静置干燥10min;(3)画疏水圈:利用Immedge TM疏水笔在检测样本周围画疏水圈2~4次;(4)切片滴加5滴RNAscope 蛋白酶plus的切片放入HybEZ TM湿盒,再放入40ħ杂交炉30min,蒸馏水清洗;(5)探针杂交:切片滴加4滴MmuPV1E4探针,再放入湿盒,杂交炉40ħ孵育2h,1ˑ清洗缓冲液清洗;(6)Amp杂交反应:依次加入Amp1~ Amp6杂交反应液4滴,分别放回湿盒,杂交炉40ħ孵育,结束后用1ˑ清洗缓冲液清洗,再依次进行下次杂交;(7)信号检测:切片上滴加120μL DAB工作液,静置10min,,蒸馏水洗3~5次;(8)切片复染:放入苏木精染色液中,室温静置2min,蒸馏水洗3~5次,0.02%氨水洗1次,蒸馏水再洗3~5次;(9)切片分别置于70%乙醇,100%乙醇孵育2min,以及二甲苯溶液,静置5min;(10)切片风干后,滴加1滴Cytoseal封片剂,盖上盖玻片,风干载玻片1min;(11)结果判读:观察MmuPV1E4转录本在感染增生组织中的表达,棕色斑点判定为阳性信号㊂2㊀结果2.1㊀MmuPV1感染尾部皮肤后外观性状MmuPV1病毒感染NU/NU小鼠4周左右,其中5只小鼠即可见尾部皮肤出现小米粒大小增生;16周后可观察到,小鼠尾部出现高于皮面,圆形或不规则形状的乳头瘤样增生,并且伴有角化过度,表面粗糙(图1)㊂收集增生组织,HE染色进行病理分析,组织学观察可见感染小鼠尾部皮肤表面鳞状上皮增生(图2A),棘层肥厚,在棘层和颗粒层出现空泡化细胞(图2B)㊂图1㊀MmuPV1感染16周后的NU/NU小鼠尾部Figure1㊀Tail skin of MmuPV1infected NU/NUmouse after16weeks2.2㊀PCR检测增生组织MmuPV1DNA MmuPV1感染增生部位提取DNA,利用MmuPV1E2基因特异性引物扩增鉴定MmuPV1表达97bp片段㊂利用感染MmuPV1的小鼠尾部提取DNA进行鉴定,结果表明均可检测到MmuPV1DNA (图3)㊂2.3㊀qRT-PCR法检测增生组织病毒载量制备MmuPV1病毒液按1ʒ5与PBS稀释后进行过滤,又追加200μL PBS㊂取5μL过滤后的病毒液提取DNA,利用实时定量PCR方法检测感染病变组织中MmuPV1的病毒载量,同样利用MmuPV1E2基因进行定量㊂结果表明,感染小鼠尾部增生部位均可检测到病毒载量,该病毒提取物中每微升含有大于1.3ˑ108viral DNA copies,RNase-Free水作为阴性对照(NC)(图4)㊂图2㊀MmuPV1感染小鼠尾部病变组织学分析Figure 2㊀Immunohistochemical analysis of mouse tail hyperplasia by MmuPV1infection注:1~15:MmuPV1感染小鼠尾部DNA 样本;16:pMusPV 质粒(阳性对照);17:未感染小鼠尾部DNA(阴性对照);18:水(空白对照);M:Trans 2k Plus DNA Marker㊂图3㊀感染小鼠尾部MmuPV1E2基因PCR 鉴定Note.1~15.Samples DNA from MmuPV1tail infection.16.pMusPV plasmid (Positive control).17.DNA from the mock mice (Negative control).18.Water (Blank control).M.Trans 2k Plus DNA Marker.Figure 3㊀MmuPV1DNA was analyzed by PCR on E2gene from virus-induced mousetails图4㊀qPCR 法检测感染小鼠尾部病毒载量Figure 4㊀Vrial load in the MmuPV1-induced mouse tails by qPCR2.4㊀RNA 原位杂交检测MmuPV1E4转录本RNAscope 原位RNA 杂交技术可呈现单个细胞中RNA 分子原位的可视化及量化㊂因此本研究利用RNAscope 原位杂交检测MmuPV1E4转录本表达,因MmuPV1E4转录本存在于大多数乳头瘤病毒早期和晚期转录过程㊂用MmuPV1E4目的探针㊁阴性探针进行检测,出现棕色信号为探针结合RNA 分子,蓝色信号为细胞核㊂结果表明,目的探针MmuPV1E4杂交后可见明显的棕色斑点信号(图5A,B),而阴性对照则只有蓝色信号(图5C,D)㊂注:A,B:RNAscope原位杂交E4转录本检测;C,D:RNAscope原位杂交阴性探针对照㊂图5㊀原位杂交检测感染小鼠尾部病变MmuPV1E4转录本Note.A,B.MmuPV1E4transcript probe.C,D.Negative probe.Figure5㊀In situ hybridization probe for detection of MmuPV1E4transcript in the infected mouse tails3㊀讨论乳头瘤病毒感染导致的相关疾病已成为世界范围内的主要问题㊂大多数HPV型感染是良性的,但如HPV16㊁HPV18等高危型HPV可导致宫颈癌㊁皮肤癌㊁头颈鳞癌以及肛门生殖器癌症等恶性肿瘤㊂皮肤疣是因感染HPV而导致的一种良性增生,儿童及青少年发病率较高,多发于手㊁面和足部,表现为圆形乳头状角化增生㊂目前的治疗方法主要以物理方法破坏疣体和手术切除,或者局部用药㊁免疫增强剂等治疗[12],但这些方法易复发㊁易感染,治疗时间久且治疗过程疼痛不适,使患者增加精神及经济负担,配合程度较差㊂HPV属于自限性病毒,在HPV感染㊁病变到致癌过程需经历数十年,而目前对于治疗中的给药途径及剂量无法系统评价,使得因HPV感染而引起良性或恶性病变的患者尚无有效治疗方案[13]㊂因为HPV感染具有严格物种特异性,前期科学家建立了棉尾兔乳头瘤病毒(CRPV)㊁多乳鼠乳头瘤病毒(MnPV1)等感染动物皮肤致病模型[14-15],但这些HPV参比模型存在个体差异大,成本高和技术有限等问题,理想的感染动物模型的缺乏很大程度阻碍了HPV感染致病机制及治疗手段的研究,因此,建立适合的动物模型进行该疾病的研究一直具有挑战性㊂MmuPV1最初是从NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu裸鼠中分离鉴定中分离得到,与皮肤型β-HPV基因组更为相似,如HPV5和HPV8等皮肤型人乳头瘤病毒,与疣状表皮发育不良及免疫抑制患者的鳞状细胞癌有关㊂前期多个科研团队已利用MmuPV1建立了尾巴,口腔周围㊁背部以及耳朵的多个小鼠品系感染模型[6,8,16-17]㊂因为免疫抑制患者更易感染而发展成疣或更高级病变,前期也有研究表明,T细胞缺陷对病毒感染及进展至关重要㊂因此,建立了MmuPV1感染裸鼠皮肤模型,显示其在尾部皮肤以及口腔周围皮肤(未发表)引起肉眼可见高出皮面的圆形丘疹,乳头瘤状外生性增生,角化过度,组织病理学分析发现空泡细胞,并可进展为高度鳞状上皮不典型增生,与人类感染HPV引起的疣状病变相似㊂通过PCR可检测到MmuPV1DNA以及利用qRT-PCR检测到病毒载量,RNAscope技术是在RNA水平利用靶向特异性双Z设计探针检测单链RNA的原位杂交,解决了尚无MmuPV1相应抗体检测及定量的问题,本模型利用RNA原位杂交技术,在MmuPV1感染小鼠尾部皮肤检测到明显的E4转录本信号,即在增生部位可原位检测到乳头瘤病毒的存在㊂多个科学家团队已证明,MmuPV1具有广泛的组织嗜性[18],不仅可感染皮肤上皮细胞,也可感染HPV性传播有关的部位,如女性与男性生殖器粘膜㊁肛门和口咽部位,头颈鳞癌等[11,17,19-22],这些结果与高危型HPV非常相似㊂综上所述,MmuPV1的发现为乳头瘤病毒多个领域的研究提供关键平台,其感染是模拟HPV病毒潜伏期㊁病变形成以及控制感染等方面更为充分的临床前动物模型,有望改变我们对HPV相关疾病的理解,并且帮助对HPV相关疾病治疗方法的建立㊂参㊀考㊀文㊀献(References)[1]㊀Ang 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使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
阿尔兹海默症转基因小鼠模型研究进展及评价周传农修改:英文摘要 ? 已修改正文中的英文书写 ? 已顺表的英文 ? 已顺文献的英文书写 ? 已修改。
书写错误太多!基本上不懂为什么要写参考文献、怎样写参考文献。
文内的红字是原来就有的。
阿尔兹海默症转基因小鼠模型研究进展及评价罕园园,马开利*(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所药物安全性评价研究中心,云南昆明 650118)【摘要】随着世界人口的老龄化,阿尔兹海默症已经成为严重威胁老年人健康的主要疾病之一,研究并建立可靠的阿尔兹海默症动物模型对于探明疾病的病因、发病机制及防治药物的开发均具有重要意义。
本文就目前使用最为广泛和研究最为深入的转基因小鼠模型的病理、行为学变化特点及其在阿尔兹海默症研究中的应用和发现作一介绍。
【关键词】阿尔兹海默症;转基因小鼠模型【中图分类号】Q95-33【文献标识码】A【文章编号】Research advance in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease and their ev aluationHAN Yuan-yuan, MA Kai-li *Center for Drug Safety Evaluation and Research, Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China【Abstract】As the world population continues to age, Alzheimer's disease has become one of the major diseases that threatens the health of the elderly population. It is very important to establish a reliable animal model of Alzheimer's disease to clarify the disease etiology, pathogenesis and promote drug development. In this article we will review the most widely used and the most in-depth studied transgenic mouse models with their pathological characteristics and behavior changes, and their application in researches of Alzheimer's disease【Key words】Alzheimer's disease;Transgenic mouse model1 引言阿尔兹海默症(Alzheimer disease, AD)的两大病理特征为老年斑(senile plaque, SP)和神经原纤维缠结(nerve fiber neurofibrillary tangles, NFTs),同时出现大量神经突触丢失和炎症反应所导致的神经元变性[1]。
小鼠基因组的分析与研究小鼠（Mus musculus）是一种常见的实验动物，因其解剖结构和生理功能与人类相似而广泛应用于生物医学研究中。
在过去的几十年，对小鼠基因组的研究取得了突破性进展，为深入理解小鼠生物学和疾病机制提供了重要支持。
本文将介绍小鼠基因组分析的主要方法和研究成果。
一、小鼠基因组测序小鼠基因组测序是研究小鼠基因组的主要方法之一。
在过去的几十年里，随着测序技术的不断发展，小鼠基因组测序的质量和效率得到了极大的提高。
2002年，小鼠基因组计划（Mouse Genome Sequencing Consortium）成功完成了小鼠基因组序列的测定，总共包括21条染色体和5条微染色体。
这项工作为小鼠与人类的遗传学相似性提供了有力证据，同时为进一步研究小鼠相关基因的功能和调控提供了基础数据。
二、小鼠转基因技术小鼠转基因技术是研究小鼠基因功能和疾病模型的主要手段之一。
它通过向小鼠基因组中引入外源基因或者使特定基因失活来实现对基因功能的研究。
目前，常用的小鼠转基因技术包括基因敲除、基因敲入、基因变异和CRISPR/Cas9技术等。
其中，CRISPR/Cas9技术由于其高效、精准和便捷的特点已经成为了研究小鼠基因组的重要工具之一。
三、小鼠疾病模型小鼠疾病模型是研究人类疾病发生机制和治疗策略的重要手段之一。
通过针对特定基因进行敲除或者突变，可以在小鼠体内模拟多种人类疾病的发生和发展过程，如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等。
同时，小鼠疾病模型还可以用于验证新药的有效性和安全性，为新药的开发提供重要的参考。
四、小鼠表型分析小鼠表型分析是研究小鼠基因功能和疾病模型的重要手段之一。
它通过对小鼠在各个方面的生理和行为表现进行系统的观察和评估，来揭示特定基因在小鼠体内的功能和调控机制。
常用的小鼠表型分析方法包括行为学测试、生理学测量和影像学分析等。
通过对小鼠表型的综合分析，可以深入理解小鼠生物学的复杂性，并对人类疾病的研究提供启示。
