下载文档原格式
芳香族化合物的降解代谢途径及其在环境修复中的应用随着人类社会的发展，越来越多的工业化生产和生活垃圾产生了大量的有机废弃物，其中就包括了许多的芳香族化合物。
这些化合物具有复杂的化学结构，对环境和生物造成严重的污染和危害。
因此，研究如何有效地降解和代谢这些芳香族化合物，让它们在一定程度上减少对环境的危害，成为了一项重要的科研任务。
芳香族化合物的降解代谢途径芳香族化合物降解和代谢的过程是一个复杂的生物化学反应过程。
在这个过程中，微生物是主要的降解代谢者，它们能通过一系列的代谢途径将芳香族化合物转化为无害物质。
一般来说，微生物降解代谢芳香族化合物的途径可以分为两种类型：一是氧化降解途径，二是还原降解途径。
氧化降解途径又分为两种：一是直接将芳香族化合物氧化为二氧化碳和水，这个过程需要的氧气非常充足，因此叫做有氧降解途径。
具有有氧降解功能的微生物有许多种，其中包括了一些常见的细菌和真菌。
另一种是先将芳香族化合物氧化为酚类化合物，再经过多步反应最终转化为二氧化碳和水。
这种降解途径需要较少的氧气，因此被称为厌氧降解途径。
还原降解途径则是将芳香族化合物还原为较简单的有机化合物或无机化合物，这种降解途径需要较少的氧气，通常发生在没有氧气的环境中。
这种降解途径的代表微生物有些亚硝酸盐还原菌。
在这些不同的降解代谢途径中，微生物通过多步反应和不同的酶促反应，将复杂的芳香族化合物转化为简单的无害物质。
其中一些代谢产物还可以作为代谢废物被其他微生物进一步分解和利用。
芳香族化合物在环境修复中的应用随着现代工业的发展，越来越多的芳香族化合物以及其他有机废弃物被排放到环境中，给环境和人们造成了严重的危害。
如何有效地减少这些污染物对环境的危害，成为了一个重要的研究领域。
目前，研究人员通过多种方式来处理有机废弃物。
其中，利用微生物代谢、降解芳香族化合物的能力被认为是一种十分可行的方式。
利用微生物降解代谢芳香族化合物的方法被称为生物修复技术。
芳香类化合物的生物降解及其机理研究芳香类化合物是一类具有特殊分子结构的有机化合物，不仅普遍存在于石油、煤炭等化石燃料中，也广泛分布在自然环境中。
然而，这些化合物常常具有很强的毒性与生物累积作用，对人类和生物环境构成了一定的威胁。
因此，如何有效降解芳香类化合物，成为了环境科学领域中较为重要的研究课题。
1. 芳香类化合物的生物降解研究芳香类化合物的生物降解是指在生物的作用下，芳香环上的碳氢键被破坏，形成氢离子和碳负离子，从而分解成小分子，最终被转化为一些对生物友好的物质。
在这一过程中，微生物是关键的降解因素。
许多细菌、真菌和酵母菌等微生物，能够利用芳香类化合物为生长所需的碳源和能源，通过代谢作用，将这些化合物降解为无害物质。
目前，已经有许多研究表明，芳香类化合物的生物降解存在很大的潜力。
例如，石油污染早期微生物固有菌能够将芳香类化合物降解为较低的物质，而后期微生物产生的腐解菌，则可以将这些较低物质继续降解。
此外，还有一些新菌株被发现能够降解较为复杂的芳香类化合物，如苯酚、苯乙烯、蒽、多环芳烃等。
2. 芳香类化合物降解的机理研究现有的芳香类化合物生物降解机制主要包括两个方面：酶催化和代谢途径。
（1）酶催化酶是生物降解过程中必需的重要催化剂，能够加速芳香类化合物的降解过程。
其中，关键的酶主要包括氧化酶、还原酶和脱羧酶等。
例如，芳香族羧酸(TCA)环的收缩是芳香类化合物生物降解过程中的关键步骤之一，该步骤受到羧化酶和去羧酶的催化作用，从而使环闭合变得容易。
此外，对一些较为复杂的芳香类化合物如多环芳烃来说，多酚氧化酶可以将其氧化而非羧化，促进其降解过程。
（2）代谢途径在芳香类化合物的生物降解过程中，代谢途径也是非常重要的。
代谢途径可以分为两个过程：门槛途径和上游途径。
门槛途径是指微生物代谢过程中，首先需要突破特定的门槛才能开始降解芳香类化合物的过程。
在此基础上，上游途径又是指通过脱羧或者去羧等代谢方式，将芳香族化合物转化为低分子化合物。
微生物降解苯并芘的研究的开题报告
一、课题背景
苯并芘（BaP）是一种常见的多环芳香族化合物，广泛存在于工业废水、大气颗粒物、尘土等环境中，对人类健康和环境造成重要的威胁。
BaP及其代谢产物具有较高的致癌性、致突变性和致畸形性，因此，对BaP的处理和清除成为了当前环境保护和污染治理领域的重要研究课题。
微生物降解是一种新兴的去除污染物的方法，已被广泛应用于废水处理和土壤修复等领域。
目前已经有一些报道显示，一些微生物具有对BaP的能力，并且能够通过途径将BaP转化为无害的物质。
因此，本研究旨在分离筛选具有降解BaP的微生物，并研究该微生物降解BaP 的效率及其降解途径等方面的问题，为环境污染治理提供新的思路和方法。
二、研究内容
1.筛选具有降解BaP微生物：利用土壤样品和活性污泥等来源的微生物，通过富集和筛选，筛选出具有降解BaP能力的微生物。
2.研究微生物降解BaP的效率：通过降解试验，研究微生物降解BaP的效率，并进行对照组实验。
3.研究微生物降解BaP的降解途径：通过气相色谱-质谱联用技术等手段，分析微生物降解BaP的降解途径及其代谢产物。
4.优化微生物降解BaP的条件：通过对微生物降解BaP的影响因素进行优化，如温度、pH、营养物质等，提高降解BaP的效率。
5.应用研究：将优选的降解BaP微生物应用于实际中的废水处理和土壤修复中，检测处理效果，并进行分析和总结。
三、研究意义
本研究可为开发新型高效、低成本的污染物处理方法提供新思路和参考，同时为环境保护和污染治理提供技术和理论支持。
此外，本研究可为建立BaP处理标准提供依据，并为BaP的环境风险评估提供实验数据。
鞘氨醇单胞菌在生物降解方面的研究进展台喜生; 冯佳丽; 李梅; 李师翁【期刊名称】《《湖南农业科学》》【年(卷),期】2011(000)007【总页数】5页(P21-25)【关键词】鞘氨醇单胞菌; 生物降解; 环境污染物【作者】台喜生; 冯佳丽; 李梅; 李师翁【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q939.1鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）[1]属于变形菌门（Proteobacteria）的α-4-亚门，细胞膜组成中含有鞘糖脂，是典型的好氧，化能自养，革兰氏阴性，杆状，通常菌落呈黄色的细菌。
鞘氨醇单胞菌广泛分布于水生和陆生环境中。
鞘氨醇单胞菌属的很多种可以降解多种化合物，如联苯（含取代基的）萘、芴（含取代基的）菲、芘（含氯的）联苯醚（含氯的）呋喃、咔唑、聚乙二醇、氯化酚和多种除草剂以及杀虫剂，在环境微生物学领域受到越来越多的关注。
1 鞘氨醇单胞菌生物降解的研究现状1.1 特殊的代谢机制鞘氨醇单胞菌属的不同种具有不同的代谢机制，因此可以降解多种有机化合物，证明该属细菌可以比其他细菌属的细菌更快更有效地适应新化合物污染的环境。
这种降解能力与通常的矿化降解机制不同。
对（含取代基的）萘或联苯降解途径的生理和酶学研究表明，鞘氨醇单胞菌与其他降解细菌并不存在显著性差异。
但是对于降解2，4-D或联苯的编码基因的研究表明，鞘氨醇单胞菌属细菌和其他变形菌门细菌只存在低水平的序列相似性。
这说明在降解机制的进化过程中，鞘氨醇单胞菌与其他变形菌门细菌之间出现差异。
鞘氨醇单胞菌与其他革兰氏阴性菌的主要区别是，通常可以在鞘氨醇单胞菌中发现不同寻常的降解基因的组成。
之前关于假单胞菌的研究表明，编码降解酶的基因一般位于相同的操纵子中，并且被协同调控，这种基因调控的经典例子是降解氯化邻苯二酚的TOL或NAH质粒编码的是间位裂解途径，而其他质粒编码的是改进的邻位裂解途径，或者是染色体编码的β-氧化己二酸途径。
有机污染物降解微生物的筛选及其代谢途径研究有机污染物是指在自然界中存在但以超过自然承载能力为代价的成分。
这些有机污染物有时会对环境和生态系统造成严重的影响。
而这些污染物的降解和净化对于生态环境的保护和生物多样性维护至关重要。
近年来，有机污染物降解微生物的筛选及其代谢途径研究引起相关领域关注。
本文将从选菌策略、代谢途径、遗传修饰等方面进行深入介绍。
一、选菌策略有机污染物降解微生物的筛选是一个复杂的过程。
重点在于寻找活跃的微生物，而后进一步研究其代谢途径。
在实践中，独立的环境样品被收集，从样品中分离出大量细菌，并通过培养实验进行筛选。
一种常见的选择方法是硫酸铵选择法和磷酸选择法。
硫酸铵选择法是将样品以适当的稀释度接种到含有硫酸铵的菌落计数对象上。
菌落计数对象只包含细菌在其上生长的最大值。
同时，在适当的温度下培养，在适当的时间点后，可以根据菌落计数结果筛选出生长最快的细菌。
磷酸选择法是在含有可溶性磷酸盐的培养基上进行选择。
磷酸盐已被证明在细菌处理有机废物的代谢过程中起关键作用。
在培养中，最终得到在磷酸选择法中生长最快的细菌，并通过测量降解率进一步筛选。
在选菌的基础之上，应用先进的基因测序技术，发现、分析微生物降解污染物的代谢途径，将呈现丰富的筛选菌种的遗传多样性。
然而，这也为研究微生物降解有机污染物的代谢途径提供了可能。
二、代谢途径微生物不同于人体内部的消化、代谢方式，微生物对有机污染物降解技术具有天然优越性。
一旦某些微生物开始接触有机污染物，他们就会出现代谢途径的重大转变。
有机污染物降解微生物的代谢途径比较复杂，常见的降解途径如下：1. 水解代谢途径水解代谢通常发生在芳香族和高分子化合物中，如多环芳烃和多聚酚类化合物等。
在水解代谢途径中，芳香族醚和聚苯醚化合物等也被以水解代谢的形式降解。
2. 氧化代谢途径氧化代谢途径是一种分子中间体的生成和氧化还原机制的复杂过程。
有机污染物降解过程中产生的氧化物可以通过氧化过程和环氧化过程得以降解。
代谢工程在芳香族化合物微生物降解研究中的应用摘要：芳香族化合物是一类对环境危害极大的污染物。
利用微生物降解此类污染物具有广泛的应用前景，综述了国内外的代谢工程在芳香族化合物的生物降解中的应用研究进展，表明生物修复技术是芳香族化合物污染环境治理最有前景的手段。
关键字：芳香族化合物代谢工程基因质粒工业技术的迅猛发展，给人类社会带来了高度的物质文明，但也带来了许多负面效应，尤其是对人类生存环境造成的危害。
芳香族化合物是一类广泛存在于自然环境中的化学物质，性质稳定，具有很大的毒性和致癌、致突变作用，而且一般都有较好的脂溶性，可以在人体和动物的脂肪组织内积蓄，从而造成长期的危害。
人工合成的芳香族化合物在利用时不可避免的泄漏到环境中造成严重的环境污染，尽管人们已经认识到了问题的严重性，这一问题仍呈上升的趋势[1]。
微生物降解环境污染物由于投资少、占地小又不需特殊设备而成为最有前途的治理环境污染的方法。
但微生物细胞在代谢繁殖过程中，经济合理地利用和合成自身所需的各种物质和能量，这种固有的代谢网络相对实际应用而言其遗传特性并非最佳,所以有必要对细胞的代谢途径进行有目的的改造。
1 代谢工程代谢工程的基本理论和应用就是在这一背景下发展起来的。
1991年Bailey[2]在“Science”上发表了一篇重要的综述文章“Toward a Science of Metabolic Engineering”，标志着代谢工程作为一门新学科的诞生。
十多年来，代谢工程的理论和应用迅速发展。
1995年Bailey[3]又发表了“Chemical Engineering ofCellular Processes”的长篇文章，详细讨论了生物网络工程及代谢工程。
1996年召开了第一次国际代谢工程会议(ME-I)。
此后，国际代谢工程会议定期两年举行一次。
1998 年出版了国际上第一部代谢工程教科书：“Metabolic Engineering : Principles and Methodologies”[4]。
大肠杆菌代谢工程生产芳香族化合物研究进展李飞飞;赵广荣【摘要】芳香族化合物广泛应用于化工、食品及医药等领域,多来自于化工合成或天然产物提取.天然微生物也具有合成芳香族化合物的能力,以维持自身生命活动代谢需求,但其积累能力较低.近几年利用代谢工程的方法对微生物特别是大肠杆菌进行途径优化、设计、改造等方法在提高其芳香族化合物的发酵产量方面取得了显著成效,并且创新地生产出多种有价值的芳香族衍生物.这些研究成果对于未来以合成生物学和细胞工厂为基础利用可再生资源进行工业生物制造,解决化石能源危机和天然产物提取等问题具有重要意义.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2014(040)006【总页数】7页(P128-134)【关键词】大肠杆菌;代谢工程;芳香族化合物【作者】李飞飞;赵广荣【作者单位】天津大学化工学院制药工程系,天津,300072;天津大学化工学院制药工程系,天津,300072【正文语种】中文芳香族化合物广泛应用于化工、饲料、食品和医药等领域，其主要的来源是石油和煤焦油工业，化学合成是工业上生产芳香类化合物普遍采用的方法。
芳香族化合物也广泛分布于自然界，是各种生物的初级和次级代谢产物，所以也有一部分芳香族产品是通过生物法获得的。
近年来，随着环保要求的提高和化石能源的减少，利用生物法合成芳香族目标化合物成为研究的热点，其中微生物发酵法是通过优良的微生物菌种在合适的条件下以葡萄糖、甘油等可再生原料发酵积累芳香族化合物。
目前对于微生物中芳香族化合物的合成途径和调控机理研究最多且阐述最为清楚的是大肠杆菌。
大肠杆菌体内芳香族化合物的合成主要通过莽草酸途径(shikimate pathway)(图1)和其下游芳香族氨基酸进一步衍生化实现。
由于大肠杆菌自身积累芳香族化合物能力很低，只有代谢途径优化改造才能更好的实现目标产物的发酵生产。
近几年通过大肠杆菌代谢工程方法生产芳香族化合物取得了显著成效，极大地提高了目标化合物的合成积累能力，这为日后研究的进一步深入和工业化生产奠定了良好的基础。
中国环境科学 2019,39(6)：2577~2587 China Environmental Science 生物降解芳香族化合物的分子检测技术研究进展厉舒祯1,2,邓晔2,3*,张照婧1,2,曲媛媛1(1.大连理工大学环境学院,工业生态与环境工程教育部重点实验室,辽宁大连116024；2.中国科学院生态环境研究中心,中国科学院环境生物技术重点实验室,北京 100085；3.中国科学院大学资源与环境学院,北京 100049)摘要：编码环羟基化加氧酶的基因常作为评价环境中微生物降解芳香族化合物能力的分子标记.近年宏基因组学技术的出现极大地加速了对环境中功能基因及功能类群的研究.本文总结了目前关于芳香族化合物环羟基化加氧酶基因的数据库,介绍了微生物降解芳香族化合物(苯系物、萘及其它多环芳烃)过程中发挥重要作用的各类功能基因,总结了环境检测中使用的分子引物,并综述了它们在各类复杂环境样本中的检测应用,此外对使用宏基因组技术来研究微生物在环境中降解芳香族化合物的能力进行了总结与展望.关键词：芳香化合物；微生物群落；功能基因；环羟化加氧酶；宏基因组中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2019)06-2577-11Advances in molecular detection on aromatic bioremediation. LI Shu-zhen1,2, DENG Ye2,3*, ZHANG Zhao-jing1,2, Q U Yuan-yuan1(1.Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, Ministry of Education, School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China；2.Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China；3.College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China). China Environmental Science, 2019,39(6)：2577~2587Abstract：Microbial genes encoding aromatic ring-hydroxylating oxygenase (ARHOs) have been selected as molecular markers for evaluating the potential of microbial degradation ability in environment. The development of culture-independent metagenomic technology has greatly accelerated the research of functional genes and functional groups on aromatic hydrocarbon degradation in recent years. This article summarized the ARHOs related databases, introduced various functional genes and corresponding primers applied to environment samples in microbial degradation of different types of aromatic hydrocarbons (benzene series, naphthalene as well as other polycyclic aromatic hydrocarbons). It also reviewed the applications of this technology in various complex environment samples. Furthermore, the future development of microbial degradation of aromatic compounds using metagenomics technologies was prospected.Key words：aromatic compounds；microbial community；functional genes；ring-hydroxylating oxygenases；metagenomics technology芳香族化合物因其具有对人体以及动植物危害极大的“三致”效应,其在环境中的迁移、转化受到了人们广泛的关注[1-3].生物降解是去除环境中芳香族化合物的最终途径[4],迄今为止已知大部分芳香族化合物的降解酶均存在于各类微生物(细菌、古菌及真菌)体内.利用微生物降解芳香族化合物安全高效、环境友好无二次污染,成为最有前途的治理环境污染的方法.微生物降解在污染物的迁移转化乃至最终消减的过程中占有重要地位,是环境中芳香化合物去除的最主要途径[5].芳香族化合物的微生物降解主要包含5个重要过程:化合物被转运进入细胞;产生苯环裂解的前体;苯环裂解;转化为三羧酸循环的中间产物;中间产物进一步代谢分解.好氧代谢由于热力学上更有利发生而备受关注[6].生活在土样表层和水体表层的细菌是主要的好氧降解者,而目前发现的大多数能以苯系物或多环芳烃 (PAHs) 为唯一碳源和能源的微生物及其功能基因也都集中在细菌的各个门之中.另外,目前已经研究透彻的降解功能基因也主要集中于细菌的好氧降解过程.环羟基化是芳香族化合物好氧降解的第一步及限速步骤,决定了微生物降解芳香化合物的能力,也是揭示微生物群落中各物种协同转化、同化、降解有机化学品的重要纽带[7].近年来随着分子检测收稿日期：2018-11-19基金项目：中国科学院前沿科学重点研究项目(QYZDB-SSW-DQC026);中国科学院“百人计划”项目* 责任作者, 研究员, yedeng@2578 中国环境科学 39卷技术的不断发展,针对芳香族化合物环羟基化过程功能基因的检测手段日渐多样,检测的通量和准确性都不断提高,并基于此设计了大量的特异性引物用于环境样本中降解菌群的检测.本文总结了目前已有的加氧酶数据库及已用于环境中功能基因和功能菌群检测的引物,综述了针对功能基因的众多分子生态学技术,并提出了未来的发展方向.1芳环羟基化加氧酶基因及分子生态学检测方法1.1芳环羟基化加氧酶的结构芳环羟基化加氧酶(ARHOs)是芳环羟基化过程中发挥重要作用的功能酶,其催化的芳环羟基化过程是芳香化合物在环境中主要的降解矿化途径[8-9].根据不同的加氧方式可以将ARHOs分为单加氧酶和双加氧酶.单加氧酶可在苯环上添加一个氧原子形成酚类化合物,同时另一个氧原子被还原为水.双加氧酶可在苯环上添加两个氧原子生成顺式二氢二醇化合物[10].ARHOs属于多组分酶系统,一般由一个或两个可溶的电子传递蛋白(铁氧化还原蛋白和还原酶)和一个终端加氧酶组成.终端加氧酶可以是同聚物(αn)或者异聚物 (αnβn) ,其中α是具有催化作用的大亚基,含有一个Rieske[2Fe-2S] 中心和单核铁,后者位于酶的催化中心.β是结构相关的小亚基,影响加氧酶最初构象,但有时也会缺失.α和β亚基共同影响底物特异性[11-12].电子通过电子传递蛋白从NAD(P)H转移电子到终端加氧酶,被还原的终端加氧酶会反过来催化氧分子上的氧原子加到芳环上,这种区域和立体专一性的加氧是生物降解过程的限速步骤,它决定和控制后续的生物降解步骤的速率和潜力[13].其中ARHO α亚基的氨基酸序列比其它组分具有更高的进化可塑性,及包含催化中心,是所有加氧酶都必需的重要组分,因而受到研究人员的青睐,常以α亚基作为标准构建不同物种中基因同源性关系及作为分子标记研究环境中存在的潜在功能基因及功能类群[14-15].1.2 ARHOs的分类及相关数据库自1990年根据其同源性差异首次对ARHOs进行分类之后,随着新的ARHOs不断发现,很多新的分类方法与类群被逐渐完善.目前对ARHOs的分类主要是根据α亚基基因或氨基酸序列的同源性及其底物特异性.已有的关于ARHOs的分类学研究如表1所示.虽然不同的分类方法略有差异,但这些酶都来自于纯培养的细菌,而可纯培养的细菌在环境总占比很少,仅不到细菌总数的1%[1],因此自然界中存在的加氧酶多样性要远高于我们的估计,宏基因组学研究也证实了这一点[16].Chakraborty等[17]在2012年根据进化关系、功能、底物结构及氧化位点对酶的分类进行了修正,从128株细菌中收集了165个ARHOs的α亚基,绝大多数来自变形菌和放线菌;另外通过全基因组数据又收集了132株细菌和7株古菌的246个ARHOs的α亚基同系物,发现除了以上两个门的细菌之外,还在蓝藻门、厚壁菌门、以及古菌的广古菌门等类群中发现了ARHOs.根据系统发育关系,Chakraborty等[17]重溯了加氧酶的进化历程.首先出现的是末端加氧酶组分,之后多种类型的电子转移蛋白出现,最后进一步演化为现存的多种加氧酶类型.表1 ARHOs的分类Table 1 Classification of ARHOs文献分类依据分类情况[9] 基于双加氧酶代谢的机制和系统发育关系划分为4组:甲苯/联苯;萘和多环芳烃;苯甲酸;邻苯二甲酸酯双加氧酶[18] 终端加氧酶α亚基氨基酸序列的同源性54个加氧酶序列划分成4组.组I包括一些低同源性的加氧酶,组II包括苯酸盐和甲苯甲酸盐双加氧酶,组III包括萘和PAHs双加氧酶,组IV是苯、甲苯、二甲苯双加氧酶[19] 终端加氧酶α亚基氨基酸序列的同源性根据52个已知的加氧酶基因,包括萘、联苯、茴香素和乙苯、苯/甲苯/氯苯双加氧酶基因;甲苯、环羟化单加氧酶基因及苯酚羟化酶基因的同源性,划分为萘和苯系物双加氧酶两大类[20] Pfam蛋白家族数据库中464个Rieske非血红素铁双加氧酶基因的同源性划分为5组:革兰氏阳性菌的PAHs双加氧酶,甲苯/联苯双加氧酶,其它双加氧酶I,革兰氏阴性菌的PAHs双加氧酶,其它双加氧酶II目前针对ARHOs的特异性数据库只有2个.2009年Arora等[12]发表了第一个加氧酶数据库OxDBase,涵盖当时已发现的具有生物降解有机物功能的加氧酶,共包含235个单、双加氧酶,并又进一步划分为芳6期厉舒祯等：生物降解芳香族化合物的分子检测技术研究进展 2579环羟化酶和环裂解酶.该数据库建立时间早,但是更新缓慢,目前也只有240余个加氧酶数据.第二个数据库为2014年Chakraborty等[21]发表了针对生物降解和生物催化过程中的细菌ARHOs数据库RHObase,共计约1000个记录,包含196个加氧酶α亚基、153个加氧酶β亚基、92个铁氧化还原蛋白、110个还原酶及131个细菌种的318个加氧反应.对于每一个蛋白序列均可以搜索其结构和保守域,还能预测输入的序列是否属于加氧酶.除此之外,还有一些包含了ARHOs的基因或蛋白序列的综合性数据库如表2所示.表2有关ARHOs的数据库Table 2 Databases on ARHOs数据库网址基本功能参考文献OxDBase /raghava/oxdbase/index.html搜索具有生物降解有机物功能的加氧酶信息 [12] RHObase http://bicresources.jcbose.ac.in/ssaha4/Rhobase/搜索加氧酶结构与保守区域;预测序列功能 [21]FunGene 基于隐马尔可夫模型从DDBJ/ EMBL/GenBank的非冗余蛋白数据库中搜索相关功能基因[22]Pfam protein families database / Rieske 家族域 (Pfam PF00355) 和Ring_hydroxyl_A家族域 (Pfam PF00848)[23]1.3环境中基于芳香族加氧酶基因的分子检测技术手段早期关于芳香族加氧酶的研究主要是在细菌纯培养体系中进行.虽然培养方法发现了一些重要的加氧酶基因,且很多至今还在广泛使用的引物都是根据纯培养菌株设计,但是培养方法效率较低,也无法反映自然状态下微生物总的降解潜力,而且实验室环境会改变微生物群落的初始结构,因此亟需更快速高效且稳定的方法提升对环境中加氧酶基因的研究.随着分子检测技术的不断发展,非培养的分子生态学方法能够同时分析多个样本,并可重复、快速、有效地检测样本中的主要序列.克隆文库、荧光原位杂交、基于PCR产物的指纹技术如变性梯度凝胶电泳 (DGGE)、温度梯度凝胶电泳 (TGGE)、末端限制性片段长度多态性技术 (T-RFLP) 等方法逐渐出现并结合培养法应用于环境样本中基因片段的检测.Kimura等[24]根据8条序列比对设计了用于半巢式PCR的引物MGED-F11/CSYH-R10, FLNQ-F3,扩增86bp的产物.他们利用PCR-DGGE 发现在表层森林土 (10~15cm) 加入氧芴或二噁英后芳环羟化双加氧酶 (ARHD) 基因的多样性更高.Bordenave等[25]根据12个双加氧酶保守区设计引物FRT5A/FRT3B, FRT6A/FRT4B扩增nahAc型基因,利用克隆文库和T-RFLP发现了两个可能的新ARHD基因,同时发现长期慢性污染(30a暴露于炼油厂废弃物)显著改变了ARHDs的多样性.虽然分子手段的通量相较于培养已有了很大的提升,但是这些低通量的方法通常只会显示优势种类的片段,或只能分离一部分片段,无法对物种进行精确鉴定并严重低估了功能微生物的多样性[26].宏基因组学的出现使得高通量检测微生物群落得以实现.高通量测序技术及基因芯片技术具有通量高、确定物种和功能准确全面,受污染干扰较小等优点,极大地促进了对环境中芳烃加氧酶基因的研究.功能基因芯片 (GeoChip) 能够特异、灵敏、定量的分析微生物群落中的功能类群,最具代表性的GeoChip涵盖了6465个芳香化合物降解基因,包括388个联苯降解探针,167个苯甲酸盐降解探针和超过2400个针对单环芳香化合物和植物芳香族化合物的探针.目前Geochip已经更新到Geochip5,包含有关芳香化合物降解基因已超过一万个,是研究芳烃降解过程功能基因的强大工具[27-28].基因芯片已经应用于微宇宙、污染土壤、地下水和沉积物等多种类型的样本中[29-31].在微宇宙实验中利用GeoChip观察到了甲苯和萘杂交信号的一致性,表明了相关降解菌的动态变化[32-33].Leigh等[34]利用GeoChip分析多氯联苯 (PCBs) 污染的土壤中细菌相应的功能基因.共检测到了27个基因,包括联苯、苯甲酸盐和其它双加氧酶亚基等.稳定同位素探针 (SIP)可以直接标记降解过程发挥作用的微生物及其基因组,消除了培养法的不足,是另一种在分子生态学中广泛使用的技术.可用13C标记降解菌的DNA,追踪发挥作用的功能基因.Martin等[35]根据11个革兰氏阴性菌序列的保守2580 中 国 环 境 科 学 39卷区域设计引物Phn -RHDf2/Phn -RHDR3,该引物对简并度较高,主要针对Proteobacteria.另一对引物RHD -Beta -Grp1f/RHD -Beta -Grp1r 简并度较低,主要针对 Betaproteobacteria.利用13C 标记DNA 并扩增特异的催化加氧基因序列,得到了2个较新的簇.Jeon 等[36]利用SIP 技术研究萘污染场地原位代谢萘的细菌,首次从底泥中分离出一株新菌CJ2,其加氧酶基因之前只在环境样本中检测到.定量PCR (qPCR) 是一种快速、定量的方法,用来检测有相同功能的一类细菌.Nyyssonen 等[32]利用qPCR 和GeoChip 得到的功能基因拷贝数相关性很好,印证了两者都是评价生物降解效果很好的工具.Nyyssonen 等[37]根据15个参考序列设计了针对变形菌门多种萘降解基因引物的nahAF/nahARev.土壤泥浆微宇宙实验表明污染物的矿化和nahAc 基因拷贝数存在较好的相关.另外基于qPCR 的方法比基于杂交(dot blot)的定量方法更灵敏,两者得到的基因拷贝数差异可达一个数量级.Piskonen 等[38]也发现qPCR 和杂交方法得出的拷贝数差异可达10倍.但是在Beller 等[39]的研究结果中两者却是一致的.Park 等[40]研究了石油污染土壤中萘降解过程nahAc 基因的动态变化,qPCR 检验萘降解速率和基因的拷贝数变化.在暴露于30×10-6萘蒸汽 6d后,nahAc 基因拷贝数增加了1000倍.从20世纪90年代开始陆续发现了很多加氧酶,并根据其核酸序列设计了特异性的引物用于研究环境中极高多样性的加氧酶基因.目前已设计的一些环羟化加氧酶基因引物如表3所示.表3 常用ARHOs 基因引物汇总 Table 3 Primers of ARHOs genes引物信息引物序列(5’–3’)产物长度(bp)参考文献nahAc -1F AAGAGCTGTACGGCGAGTCnahAc -1R CCTGATCGAAGCAACCATAGnahAc -3F GACGCTGCTTGGTACCTAGAnahAc -3R TCCAGTTGGCCTTGATCA nahAc -6F TGATCAAGGCCAACTGGA 33种革兰氏阳性菌的萘双加氧酶基因nahAc ,比对后根据同源区域设计引物.底物为萘及其它PAHsnahAc -6R AGCGACGCGAAGATAGACTC84~136 [40]NahAc -forward CAGAGCGTYCCRTTYGAAAA NahAc -reverse TCGAAGCAACCRTARATGAA 18株革兰氏阳性菌Pseudomonas 设计萘双加氧酶基因nahAc ,底物为萘及其它PAHs NahAc -probe TGGGGTTGAAAGAAGTCGCTCG nidA -forward TTCCCGAGTACGAGGGATAC nidA -reverse TCACGTTGATGAACGACAAA 根据9株革兰氏阴性PAH 降解菌Mycobacterium设计nidA ,底物为萘及其它PAHs nidA -probe TCCTACCCGTCGCCGGTACA[41]todC1F GCGAGATAGAAGCGCTCTTT甲苯双加氧酶基因tocC1,底物为甲苯 todC1R GTATTGATACCTGGGAGGAAG 942 [42]BPHD -f3 AACTGGAARTTYGCIGCVGA 根据联苯双加氧酶基因设计引物.应用于PCB 污染的土壤 BPHD -r1 ACCCAGTTYTCICCRTCGTC524 [16] bphAf371-B (F1)GGCTTTCACCTGCASYTAYCAYGG 530 (F1/R) bphAf668-3 (F2) GTTCCGTGTAACTGGAARTWYGC 799-826 (F2/R)31株细菌设计引物,底物为苯系物 bphAr1153-2 (R) CCAGTTCTCGCCRTCRTCYTGHTC [43]PAH -RHDα GP F CGGCGCCGACAAYTTYGTNGG PAH -RHDα GP R GGGGAACACGGTGCCRTGDATRAA 292PAH -RHDα GN F GAGATGCATACCACGTKGGTTGGA 根据20个革兰氏阴性降解菌的功能基因片段nahAc ,nahA3,nagAc ,ndoB ,ndoC2,pahAc ,pahA3,ph nAc ,phnA1,bphAc ,dntAc ,arhA1和15个革兰氏阳性降解菌的功能基因片段narAa ,phdA/pdoA2,nidA/pdoA1,nidA3/fadA1设计PAH -RHDα GN RAGCTGTTGTTCGGGAAGAYWGTGCMGTT306[10] pah -rhdα-396F ATTGCGCTTAYCAYGGBTGG覆盖革兰氏阴性菌的nahAc ,phnAc ,nagAc ,bphA1,ndo -3, ndo -5及革兰氏阳性菌的phdAc ,narAa ,nidA 等40个RHDα基因设计引物pah -rhdα-696R ATAGGTGTCTCCAACRAARTT 320 [44]目前多数的研究都表明,在多种污染条件和不同环境类型中,功能基因丰度与污染物浓度或降解速率之间都存在显著的正相关关系.Yergeau 等[45]利用GeoChip 和qRT -PCR 研究了引物PAH -RHDα6期厉舒祯等：生物降解芳香族化合物的分子检测技术研究进展 2581GN F/PAH-RHDα GN R检测的降解菌群落,发现功能基因丰度和萘矿化速度显著相关.Wu等[46]首次研究了珠江口沉积物(0~10cm)中PAH-RHD基因多样性和分布.冗余分析表明NH4+-N, NO3--N, ∑PAHs, pH值, SiO32--Si与革兰氏阴性菌的加氧酶功能基因(PAH-RHD[GN])正相关,而PO43--P,水深与 PAH-RHD[GN]负相关.Xia等[47]利用半巢式PCR考察了长江中游沉积物、悬浮沉积物及上覆水(表层沉积物1m以上)群落中萘、菲降解菌携带的nahAc和nidA 基因的多样性,发现PAH-RHD[GN]基因多样性及nahAc和nidA基因拷贝数存在沉积物>悬浮沉积物>上覆水的规律,且nahAc和nidA基因拷贝数和环境因子无显著相关,但与萘、菲生物可利用量的多少显著相关.Lozada等[48]研究菲、苯并(a)蒽、苯并(a)芘等不同水平PAHs污染的近海海岸沉积物(0~3cm),发现ARHD基因型数量和PAHs含量存在强相关关系(r=0.834, P<0.05).Tuomi等[49]发现微宇宙实验中,好氧污染样本nahAc基因和萘矿化速度、微生物总量、呼吸速率、有机物含量相关(r2=0.34-0.47, P<0.01).Dionisi等[50]发现煤焦油污染的淡水沉积物中萘的浓度和nagAc型基因拷贝数相关(nagAc- DNA/ug, r=0.89;nagAc-干重沉积物/g, r=0.77).Wu 等[51]利用qPCR发现引物PAH-RHDα GP F/PAH-RHDα GP R扩增得到的农业土壤样本革兰氏阳性菌中的PAH-RHDα和PAHs含量显著相关(r=0.409),而与土壤pH值, TC, TN, TP, NH4+, NO3-等无相关性.众多研究中的相关性再次印证了RHDα可作为良好的分子标记应用于污染环境中功能基因和功能类群多样性的研究.2针对不同芳香族化合物的分子检测应用2.1苯系物苯系物,即芳香族有机化合物 (MACHs),是指苯、甲苯、乙苯、二甲苯、三甲苯、苯乙烯、苯酚、苯胺、氯苯、硝基苯等苯及其衍生物,因其具有高挥发性和高毒性而成为污染物降解领域的热点.而目前对于苯系物的微生物降解功能基因的研究主要集中于苯、甲苯、乙苯、二甲苯、联苯等物质.Hendrickx 等[52]根据苯系物降解基因tmoA, xylM, todC1, tbmD的片段设计了不同的引物,并检测了苯系物污染不同地点、深度土壤细菌群落和基因多样性的分布.苯系物污染地区中检测到的优势菌为Actinobacteria和Proteobacteria,功能基因中tmoA是最主要的降解基因.tmoA在污染、非污染地区都有检出,而xylm只在污染地区发现.tmoA型基因在不同的α-Proteobacteria如Agrobacterium、Sphingomonas 以及革兰氏阳性菌Arthrobacter中检出,xylM型基因在Sphingomonas和Rhodococcus中检出.tmoA和xylM基因片段在系统发育关系很远的菌株中出现证明了2个苯系物代谢基因之间的水平转移现象.随后,Hendrickx等[53]通过中宇宙实验用相同引物检测降解菌群的原位动态变化也得到了相似的结论.另外,萘和苯系物降解基因的相关性在多个研究中都得到了证明.Iwai等[16]根据联苯双加氧酶基因设计引物BPHD-f3/BPHD-r1,并应用于PCB污染土壤,成功扩增出萘双加氧酶基因和一些新的双加氧酶基因,验证该引物的覆盖度较广.Baldwin等[19]利用不到10个参考序列分别设计了针对萘、联苯、甲苯、二甲苯双加氧酶及苯酚单加氧酶的多对引物BPH1-F/BPH1-R, BPH2-F/BPH2-R, BPH3-F、BPH4-F/BPH3-R, TOD-F/TOD-R,产物长度从206~757bp不等.qPCR结果表明在苯、甲苯、乙苯、二甲苯污染的环境样本中检测到的萘双加氧酶基因拷贝数和污染浓度呈正相关关系.利用植物、动物等生物修复技术治理苯系物污染是环境修复领域的研究热点.de Carcer等[54]利用引物bphA668-3/bphAr1153-2 进一步考察了多氯联苯污染土壤在用柳树进行植物根际修复后细菌群落及联苯双加氧酶基因的变化.PCR-TGGE和测序结果表明污染土壤和根际土中细菌群落及其代谢水平都存在显著的差异.非根际土和根际土分别构建了48、47个克隆子的克隆文库,且非根际土克隆文库多样性高于根际土.根际富集了降解PCBs过程中发挥重要作用的Proteobacteria和革兰氏阴性菌的降解基因,柳树对PCBs降解菌产生了正向的作用.此外,Li等[55]利用植物修复PCBs污染的土壤发现植物显著提高了土壤中PCB降解菌的数量及其对PCB的移除效率, bphA, bphD等基因数量在植物存在时显著提高.Luepromchai等[56]根据8条序列比对设计引物A13-gc/A1r.考察土壤中加入蚯蚓后PCB降解菌Ralstoniaeutrophus和Rhodococcus sp. ACS功能基因的变化.结果表明蚯蚓加入后增加了2582 中国环境科学 39卷PCBs降解菌的数量和bphA基因数量,提升了生物降解速率.2.2萘及其它多环芳烃萘的降解一直是过去几十年关注和研究的重点,是研究多环芳烃生物降解的模式化合物[57].而萘双加氧酶具有多种酶的活性,不仅可以催化萘和具有类似结构的芳香族化合物如菲、蒽、甲基萘、二苯并噻吩等双加氧;还可以催化多种芳香烃或苯环结构化合物的单加氧过程[58].研究萘双加氧酶基因对认识分解代谢质粒的行为、细菌遗传信息的水平转移、加氧酶基因和酶的进化提供了新的见解;提高了有效管理、处理污染环境以及为新技术开发新型酶的能力[59].1964年第一次报道了来自Pseudomonas sp.的萘降解途径[60].Pseudomonas sp.在多种污染环境中都存在且在污染后得到富集,在快速降解污染物阶段也是优势物种[37].迄今为止大多数分离的萘降解菌仍属于Pseudomonas,其催化组分称之为萘1,2-双加氧酶(NDO),具有α3β3的亚基结构.其中α亚基具有催化作用,基因在不同细菌中高度保守,通常被用于分子标记.基因的水平转移使得很多物种携带了NDO基因[40].许多革兰氏阴性菌如Pseudomonas, Burkholderia, Comamonas及革兰氏阳性菌如Mycobacteria, Rhodococcus已发现具有萘双加氧酶系统[61-62].很多特异性的引物也被设计用于扩增特定降解菌中的功能基因.Wang等[63]在含盐土壤中以菲为唯一碳源富集得到一株嗜盐的菲降解菌CY-1,属于Marinobacter,通过引物PAH-RHD-396F/ PAH-RHD-696R 发现其加氧酶基因类似于nah型基因,是由nah相关基因簇通过水平基因转移进化而来的新型基因簇hpah,并发生了耐盐性进化.通过RT-PCR进一步证明了hpah的表达.该研究首次克隆并表达了耐盐的nah型的双加氧酶基因.Marcos 等[64]采集PAHs慢性污染的亚南极海洋沉积物建立克隆文库.利用20株海洋细菌Nocardioides, Mycobacterium, Rhodococcus比对保守区域设计了针对革兰氏阳性菌的引物NMR331f/NMR1134r,发现了14种不同的基因片段,大多与Nocardioides, Mycobacterium, Rhodococcus, Terrabacter, Bacillus 这几个属的双加氧酶相关,但是氨基酸水平上的相似性较低(33%~62%),证明了极端环境中加氧酶基因的高可变性.极端环境十分脆弱,易受到污染,低温也会减弱污染物的降解速率,一旦受到污染难以消除,对于极端环境中污染物的消解与功能基因的类群还需要继续深入研究.红树林是热带和亚热带沿海独特的潮间带湿地,受到人为污染非常严重.Gomes等[65]研究了暴露于不同PAHs污染的红树林沉积物中ndo基因多样性.根据21条参考序列设计了引物NAPH-1F/NAPH-1R, NAPH-2F/NAPH-2R.巢式PCR-DGGE和Southern 印迹杂交都证明ndo基因的分布具有地点特异性.在红树林生态系统中ndo和nag型基因丰度很高,没有检测到nahAc.该结果表明ndo基因相较于广泛研究的nahAc和phnAc可能在红树林生态系统萘降解过程中发挥重要作用.由于PAHs可溶性低且迁移率低,地理位置对降解基因的多样性及丰度影响极大[18].Lozada等[66]采集潮间带沉积物(0~3cm)样本并建立克隆文库.发现样本中不同基因簇的数量和PAHs的种类高度相关.Yagi等[67]使用引物Rieske_f/Rieske_r发现nah 和nag基因共存于煤焦油污染的含水层群落中,而不同时间地点特异性的地化性质导致了不同基因丰度变化很大,煤焦油附近淡水沉积物中nagAc型基因丰度可以作为萘污染的指示基因[50].Ding等[44]发现菲降解过程中ARHD基因的丰度、多样性及系统发育关系是由土壤类型决定的,但是其多样性和丰度如何被不同的土壤类型影响在很大程度上仍属未知.虽然ARHD具有地点特异性的属性,但相隔很远的ARHD基因之间也存在一致性.Parnell等[68]的研究发现基因的水平转移使得功能基因的相似性要高于基于16S rRNA得到的物种分类上的相似性.对phnAc的系统进化分析表明phnAc发生了基因水平转移,几乎完全一样的基因出现在了系统发育距离很远的菌株中[59].另外在南美洲和南极洲、亚洲和欧洲发现了一些共有的微生物及相同的等位基因,表明了扩散效应(风、洋流、宿主)使得基因发生了大范围的扩散[69].随着鉴定出的降解菌属及基因多样性越来越高,革兰氏阴性和阳性菌中的PAH-RHDα出现了较为明显的区分,研究者可以在此基础上设计覆盖度更高的引物[16].Ding等[44]根据40个革兰氏阳性和阴性菌的多种PAHs的羟化酶大亚基基因(PAH-。
