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实时荧光PCR定性检测1．引物和探针大豆及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列。
2．实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表11—16，反应体系中各试剂的用量，可按照详细状况或不同的反应总体积举行适当的调节。
每个反应体系应设置两个平行测试。
3．实时荧光反应参数实时荧光定量PCR的反应参数为：37℃，5min；预变性，95℃，3min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
不同仪器可按照仪器要求将反应参数作适当调节。
4．实时荧光．PCR结果分析 (1)阈值设定实时荧光PCR反应结束后，应设置荧光信号阈值，普通挑选3～15个循环的阴性对比的10倍标准差作为阈值。
阈值设定原则按照仪器噪声状况举行调节，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
(2)实时荧光PCR定性检验的质量控制空白对比：外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值大于或等于40。
阴性对比：外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在20～30。
阳性对比：外源基因检测Ct值小于或等于34。
上述指标有一项不符合者，应重新做实时荧光PCR扩增。
(3)实时荧光PCR结果判定测试样品外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值20～30者，阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常者，则可判定该样品未检出转基因成分。
测试样品外源基因检测Ct值小于或等于36．内参照基因检测Ct值20～30者，阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常者，则可判定该样品检出转基因成分。
测试样外源基因检测Ct值在36～40，应重做实时荧光PCR。
再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常，则可判定为该样品检出转基因成分。
再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常，则可判定为该样品未检出转基因成分。
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转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立一、背景介绍Bt汕优63是一种经过基因工程技术改造的转基因水稻品种，通过引入Bt基因，使其具备抗虫特性，有效减少农药使用，保障粮食安全。
为确保Bt汕优63中外源基因插入结构的稳定性和表达量，本研究旨在建立一套针对其外源插入结构的验证和定量检测方法。
二、外源插入结构验证方法1. DNA提取从Bt汕优63植株中提取基因组DNA，作为后续实验的模板。
2. PCR扩增设计特异性引物，针对Bt基因及其侧翼序列进行PCR扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证Bt基因是否成功插入水稻基因组。
3. 序列分析将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，确认插入位点和序列的正确性。
三、定量检测方法建立1. 实时荧光定量PCR（qPCR）以Bt基因为目标，设计特异性引物和探针，建立qPCR检测体系。
通过标准曲线法对Bt基因在水稻基因组中的表达量进行定量分析。
2. qPCR实验步骤（1）制备cDNA：以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA。
（2）配制qPCR反应体系：包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。
（3）设置qPCR反应程序：包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。
（4）数据分析：采用软件分析Ct值，根据标准曲线计算Bt基因的相对表达量。
四、方法优化与验证1. 优化实验条件：对qPCR反应体系中的引物浓度、探针浓度、退火温度等进行优化，确保检测体系的灵敏度和特异性。
2. 重复性实验：进行多次独立实验，验证检测方法的重复性。
3. 线性范围验证：通过制备不同浓度的标准品，构建标准曲线，验证检测方法的线性范围。
本研究成功建立了Bt汕优63外源插入结构的验证和定量检测方法，为后续转基因水稻的监管、研究和应用提供了有力的技术支持。
通过这些方法，可以确保Bt汕优63中外源基因的稳定性和表达量，为我国转基因作物的发展和安全提供保障。
六、实验操作注意事项1. DNA提取过程中的注意事项确保实验过程中使用的器械和容器无菌，避免DNA污染。
的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37]贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology and Medi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
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并且这种离心式的设计还消除了管和管之间的差异及边缘效应，而传统板式仪器由于板块内部温度的差异和复杂的光路系统无法具备Rotor-Gene Q 的这些出色性能。
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期：2008-03-05基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2）作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者：教授，博士生导师，E-mail:gaoxj5390@敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2（1．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点，使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词：实时荧光定量PCR ；Taq Man 探针法；SYBR Green I 染料法；转基因检测中图分类号：TS207.3文献标识码：A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction ，RQ-PCR ）发展起来，RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线，对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
食品中的转基因成分检测方法转基因技术是现代生物技术领域的一项重要技术，通过在食品作物中引入外源基因，可以提高作物的产量、抗病虫害能力以及改善其品质。
然而，随着转基因食品的广泛应用，人们对于食品中是否存在转基因成分的关注与日俱增。
因此，开发准确可靠的转基因成分检测方法成为食品安全监管和消费者权益保护的重要任务之一。
一、PCR方法PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的转基因成分检测方法。
它通过扩增目标DNA片段，然后进行特定基因的检测，以确定食品样品中是否存在转基因成分。
PCR方法的原理是利用DNA聚合酶在模板DNA的引导下，不断扩增目标基因区段，最终可以从食品样品中获得足够数量的转基因 DNA 片段。
PCR方法具有高灵敏度、高特异性、操作简便等优点，因此被广泛应用于转基因食品的检测领域。
二、荧光定量PCR方法荧光定量PCR是PCR方法的一种改进形式。
通过引入特定的荧光探针，可以实现对转基因成分的快速、准确的定量检测。
该方法利用特定荧光探针与目标DNA结合，产生荧光信号，并通过荧光实时监测的方式，定量检测样品中的转基因成分含量。
荧光定量PCR方法具有灵敏度高、准确性强、操作简单快速等优点，被广泛应用于食品安全监管和质量控制。
三、基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量、高灵敏度的转基因成分检测方法。
该技术通过将大量的特异性的探针固定在芯片上，可以同时检测多个基因。
食品样品的DNA与芯片上的探针发生特异性的杂交反应，然后通过荧光或其他信号检测出转基因成分的存在和含量。
基因芯片技术具有多重检测、高通量、高灵敏度等特点，能够更全面、准确地检测食品中的转基因成分。
四、下一代测序技术下一代测序技术是近年来快速发展的高通量测序技术。
它可以对DNA样本进行高效、全面的测序，并通过比对分析，检测出其中存在的转基因成分。
相较于传统的PCR方法，下一代测序技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等特点，能够准确检测出转基因成分的存在和含量，对于食品检测具有重要的应用前景。
分析 检测 孙娜 张颖 青岛市产品质量监督检验研究院实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
研究表明，每个模板的Ｃｔ值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ｃｔ值越小。
利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ｃｔ值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用方法。
实时荧光定量ＰＣＲ技术在化学原理上可以分为两类，分别是非探针类和探针类；其中探针类是利用探针来指示扩增产物的增加，常用的方法有ＴａｑＭａｎ探针法；非探针类是利用荧光染料来对扩增产物的增加进行实时监控，常用的有ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ检测法。
实时荧光定量ＰＣＲ技术在转基因食品领域中的应用定量分析策略。
在实时荧光定量ＰＣＲ技术中，模板定量方法主要有两种，分别是相对定量和绝对定量。
（１）相对定量。
主要是指在一定的样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化，相对定量又分为比较Ｃｔ值法和标准曲线法，主要是依据相对定量方法是否需要建立标准曲线来区分的。
比较Ｃｔ值法是不需要建立标准曲线的，但是它的前提是以靶基因和内源控制物的扩增效率保持基本一致，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。
这种方法计算出的相对定量结果通常比实际结果要高，误差较大。
标准曲线法首先要准备好标准品，其中包括目的的基因和内参基因的标准品，然后根据设定的梯度进行准确的配比稀释，一般是以１／１０的梯度倍比进行稀释，然后制成标准曲线，通过标准曲线得到目的基因和内参基因的值，并将这两个基因的比值作为定量的最后结果。
这种方法所得出的结果根据某个参照物的量而言的，且这种方法制作起来比较简易，只需要知道标准品的稀释倍数就可以了。
（２）绝对定量。
主要是指已知的标准曲线来推算出未出的样本的定量。
在使用这个方法时首先要克隆目的基因和参照基因的扩增片段，然后构建体外转录系统，通过体外转录获得已知拷贝数的标准品来构建标准曲线，这种方法具有 稳定、准确的优点。
PCR检测转基因大豆：[目的]定性检测转基因大豆。
[方法]以非转基因大豆和CP4-EPSPS 转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)为检测的目的片段,建立PCR反应体系。
采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA, 并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立：采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R 的定量PCR检测方法。
该方法的检测灵敏度 <0 0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 0倍用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品：用从转基因大豆(Glycinemax )颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。
结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10-14g/μL的溶液。
用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeepinggene)。
ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究：以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。
此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4 EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。
转基因玉米的鉴别方法转基因玉米的鉴别可以采用许多复杂的技术，如分子标记分析，流式细胞术，实时定量PCR（qPCR）分析，蛋白分析，原位杂交等。
不过，可能也需要结合抗性检测或外部鉴别等方法。
其中常用的鉴定方法包括：（1）PCR 技术：它是利用脱氧核糖核酸（DNA）特异序列引物以及Taq 酶在反转录-聚合酶链反应（PCR）对转基因玉米的标志基因位点进行检测的一种技术，可以在体外快速、准确的鉴定不同的转基因玉米类型。
（2）分子权重（w）分析：它是利用核酸序列的分子量（mw）或分子量值来鉴定转基因玉米的一种技术，通过比较转基因玉米基因组DNA的分子量值与对照群体完全不同的DNA分子量值之间的差异，从而可以发现转基因玉米特有的特征。
（3）DNA 指纹：它是一种利用一系列剪接酶来生成特定基因组DNA片段的技术，可以用来鉴别转基因玉米的品种和基因组结构的变化。
（4）十二碳溴代酰胺（DCC）方法：它是一种利用基因片段中的三磷酸核苷（ATP）酶活性来鉴定转基因玉米特征的技术，可以利用电泳和有机溶剂中和镜翻转作为反应条件来鉴定基因片段的ATP 活性构成和构成比例，从而进行结果判断。
二、临床应用检测转基因玉米被广泛应用于药用植物、食物营养研究中，以及转基因产品的供应链及食品中的安全性研究中。
1. 检测转基因玉米的安全性研究：主要用于分析转基因玉米中毒性和敏感性的机制、治疗疾病进程及临床应用前的安全性评价等。
2. 转基因产品的供应链管理及检测：通过检测转基因玉米以及它在从种子到品牌食品所处的每个环节可以发掘出转基因物质在食品中是否合法。
3. 营养食品研发：通过系统地建立序列和功能数据库以及筛选和鉴别转基因玉米中的营养物质和抗耐性基因，找到一种能健康滋养身体的有效营养物质，用于营养食品的研发。
转基因黑豆辨别方法
1. 遗传标记方法：通过分析基因序列或比较不同品种的基因组，可以找到与转基因黑豆相关的特定基因型标记，从而进行辨别。
2. 蛋白质组学方法：通过分析转基因黑豆与非转基因黑豆的蛋白质质谱图谱差异，可以鉴别出是否存在转基因黑豆。
3. PCR方法：利用转基因黑豆与非转基因黑豆的特定序列区域的差异，设计引物并进行PCR扩增，通过检测扩增产物的长度或序列进行辨别。
4. 实时荧光定量PCR方法：通过加入特定的探针来检测转基因黑豆与非转基因黑豆基因的表达量差异，从而进行辨别。
5. DNA测序方法：通过对转基因黑豆与非转基因黑豆的DNA进行测序，分析其序列是否与已知的转基因黑豆序列相匹配，从而进行辨别。
以上方法需要特定的实验设备和技术人员的支持，并且需要获得基因信息或相应的检测试剂盒。
因此，在实际操作中，可能需要委托专业实验室进行转基因黑豆辨别。
实时定量PCR方法检测转基因产品马荣群1 陈红运2 黄文胜2 朱水芳2(1.西北农林科技大学 杨陵 712100 2.国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所)摘要 实时定量PCR方法检测转基因产品,操作简单,省时省力,结果可靠、准确性高。
该方法利用特异性荧光探针实时监测目的基因的扩增,同时循环参数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。
利用阳性标准样品的Ct值,制成标准曲线,再根据未知样品的Ct值就可以准确确定起始DNA的数量。
高纯度探针和适宜的镁离子浓度是该方法准确定量的关键。
实时定量PCR方法有效地解决了其他定量方法所存在的假阳性及定量准确度不高的难题。
关键词 实时定量PCR 荧光探针 转基因检测 随着现代分子生物学技术的飞速发展,转基因产品(GMO)日益走进人们的生活。
自从1983年转基因技术成功地应用于植物以来,全世界转基因农作物的种植面积迅速扩大,其中以美国、加拿大、阿根廷、澳大利亚等国种植面积较广。
转基因作物种类主要有大豆、玉米、油菜、棉花、马铃薯、番茄等,其表型主要包括抗虫、抗病毒以及抗除草剂等。
理论上,只要知道任何生物的核酸序列,就可以进行转基因操作,因此,转基因技术应用的潜力是巨大的。
然而,转基因产品的安全性以及转基因生物对人类健康的生态环境的影响引起了世界各国的普遍关注。
欧盟、日本、韩国和俄罗斯等国已开始对转基因食品实行标签制度,要求进口农产品注明转基因产品的种类和含量。
中国加入世贸组织后,随着关税的降低和农产品市场的开放,国外的农产品必将以其优良的品质和低廉的价格大量涌入,而我国进口的粮食、大豆、食用油等大部分来自美国、加拿大等转基因技术发达、转基因农作物栽培面积较大的国家。
因此,建立快速、简便、准确的转基因检测方法非常必要。
实时荧光定量PCR是新近出现的一种定量检测方法,PCR扩增后采用荧光显示,算法更为精确[1,2]。
1 几种传统定量PCR方法简介[3]1.1 内参照法在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记,下游引物不标记。
在模板扩增的同时,内标也被扩增。
在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照对待检测模板进行定量。
1.2 竞争法选择由突变克隆产生的含有一个新内切酶位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。
扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被切割,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数[4,5]。
1.3 PCR-EL ISA法利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体—辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。
常规的PCR -EL ISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的[6]。
2 定量所用参照物PCR技术应用于核酸的定量检测早有报道,但技术上的不成熟阻碍了其广泛应用。
PCR在定量过程中须广泛借助于各种形式的参照物[7,8,9]。
参照物在定量PCR中具有以下作用:a.作为扩增系统的阳性对照;b.作为未知样本定量的参比标准;c.通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率,使其具有可比性。
参照物按其性质不同可分为内参照(内标)和外参照(外标)。
由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差,无法直接从终点产物量推算出起始模板量。
加入内参照后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。
美国得克萨斯大学的科研人员对外标法定量和内标法定量进行了比较,认为将内标法作为定量或半定量的手段不可靠,而外标准曲线的定量方法是准确的、值得依赖的方法[10]。
3 实时荧光定量PCR技术上述几种传统定量PCR方法,一直面临着两大难题,PCR的假阳性污染和定量的准确度。
用这些方法进行检测,都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程,而这些处理过程很易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中,使PCR假阳性污染成为可能,尤其是电泳所用染色剂EB(溴化乙锭)为强烈致癌物质,若操作不当,会严重危害操作者的健康。
另一方面,所有这些方法的定量都是针对PCR终产物来进行的,而PCR的平台效应在一定程度上干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性,使定量准确度难以提高[7,8]。
与这些传统方法不同,实时定量PCR方法采用完全闭管检测,不需PCR后处理,避免了交叉污染;采用实时监测技术,定量PCR仪采用激光器光源,保证高能稳定无干扰的荧光激发,由一系列透镜、滤镜和一个双色镜组成的光学系统将激发荧光聚焦到光谱仪上,光谱仪以间隔的方式将荧光按照波长的不同分开,进入CCD相机,序列检测应用软件从CCD相机中收集这些荧光信号,对数据进行分析。
从检测开始到定量结束,整个过程耗时短,操作方便。
这种方法采用一个双标记荧光探针来检测PCR产物的积累,可非常精确、重复地定量基因拷贝数,并且比一般的定量方法劳动强度小[1,2]。
3.1 实时荧光定量PCR原理[1,2]实时荧光定量PCR技术,是指在PCR 反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。
实时定量PCR技术是在常规PCR基础上,添加了一条标记了两个荧光基团的探针。
一个标记在探针的5′端,称为荧光报告基团(R);另一个标记在探针的3′端,称为荧光抑制基团(Q)。
两者可构成能量传递结构,即5′端荧光基团所发出的荧光可被荧光抑制基团吸收或抑制。
当二者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强。
荧光信号随着PCR产物的增加而增强。
实时定量PCR方法就是利用此原理,在PCR过程中,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。
当信号增强到某一阈值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,此时的循环次数(Ct值)就被记录下来。
该循环参数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。
利用阳性梯度标准品的Ct值,制成标准曲线,再根据样品的Ct值就可以准确确定起始DNA的数量。
3.2 实时荧光定量PCR所用荧光探针目前应用于实时定量PCR检测体系中的荧光探针主要有两种:一种是TaqMan探针[10],一种是分子信标探针[11～12]。
Tyagi 和Krammer(1996)首次建立了分子信标探针,在同一寡核苷酸探针的5′端标记荧光素、3′端标记淬灭剂(DABCY L)。
分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA 无关的碱基互补的臂。
无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂, DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。
当探针遇到目的DNA分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,使两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。
影响分子信标探针构型变化的参数主要有:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4-12个核苷酸可形成稳定的杂交茎。
噜扑环长度至少应是臂长的2倍,才能保证探针与目标DNA杂交及荧光素与淬灭剂分开。
TaqMan探针是一段5′端标记报告荧光基团,3′端标记淬灭荧光基团的寡核苷酸。
报告荧光基因如FAM共价结合到寡核苷酸的5′端。
TET、V IC、J OE及HEX也常用作报告荧光基团。
所有这些报告荧光基团通常都由位于3′端的TAMRA所淬灭。
当探针完整时,由于报告基团与淬灭基团在位置上很接近,导致其报告荧光的发射主要由于Forster型能量传递而受到抑制[13]。
在PCR 过程中,上游和下游引物与目标DNA的特定序列结合,TaqMan探针则与PCR产物相结合。
TaqDNA聚合酶的5′-3′外切活性将TaqMan探针水解。
而报告荧光基团和淬灭荧光基团由于探针水解而相互分开,导致报告荧光信号的增加。
T aqMan探针的3′端则经过化学修饰,以防止其在PCR过程中被延伸。
探针与产物的结合发生于PCR的每一循环,但并不影响PCR产物的指数积累。
报告荧光基团与淬灭荧光基团的分离导致报告荧光信号的增加,而荧光信号的增加可被系统检测到,它是模板被PCR扩增的直接标志。
引物和探针都必须与模板结合(杂交),才能实现PCR扩增和探针的水解;与探针特异结合的DNA模板得到扩增时才能产生荧光信号。
基于这两点要求,即使发生非特异性扩增,也不会影响检测结果。
荧光定量检测的主要影响因素在于所用探针的纯度以及镁离子浓度,二者在很大程度上决定了检测结果的真实性和可靠性。
探针的纯度直接影响探针荧光本底的高低。
任何标记报告基团而无淬灭基团的分子都是污染源,未淬灭的报告荧光使探针的荧光本底增高,导致难以辨认由于探针裂解而产生的报告荧光的变化。
同时由于探针标记不完全,即只标记了报告荧光素或只标记了淬灭荧光素或二者均未标记上,这样,即使荧光探针与扩增产物结合,也不能检测到荧光信号的增长,很容易造成假阴性。
另外,镁离子浓度的高低也直接影响了检测的灵敏度。
4 实时定量PCR技术应用于转基因产品检测对转基因产品进行定量检测,国外已有文献,国内尚未见相关报道。
转基因产品的检测可以从核酸和蛋白质水平上进行检测[12]。
定量检测主要是基于核酸水平的检测,由于目前转基因技术中使用的基因构件主要来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S 启动子和农杆菌的NOS终止子,绝大部分转基因产品含有这两个基因片段,所以检测35S启动子和NOS终止子基本可达到检测转基因产品的目的。
但由于35S来源于花椰菜花叶病毒,十字花科的植物(如油菜)易自然感染CaMV,如果对进口转基因油菜针对35S设计引物进行检测,则可能将感染CaMV的非转基因油菜判定为转基因产品,从而引起贸易纠纷。
鉴于此,对这类产品应进行目的基因检测。
