北方民族大学学生实验论文论文题目:产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育
院(部)名称:生物科学与工程学院
学生姓名:杨嘉怡
专业:生物工程学号:20103371班级:102班
指导教师姓名:刘雅琴
实验小组成员:高瞻，邢艳东，刘帅，阳波
组别:第五组
实验成绩:
北方民族大学教务处制
产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育
摘要
酶（英语：Enzyme，又称酵素），指具有生物催化功能的高分子物质。几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种。在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。本实验中，将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线对微生物诱变作用，对菌株进行选育工作。
关键字：芽孢杆菌，分离，突变，筛选
1．实验仪器和材料
1.1仪器
显微镜，恒温水浴锅，酒精灯，接种针，无菌移液管，无菌涂布器，无菌试管，量筒，1mL无菌吸管，烧杯，磁力搅拌器，培养皿，高压灭菌锅，玻璃涂棒，游标卡尺血，紫外线等（15W），细胞计数板。
1.2材料及试剂
土壤样品，牛肉膏蛋白胨培养基平板，酪蛋白平板，无菌生理盐水，芽孢染色液。2实验方法
2.1分离
[1]培养基和试剂的配置
酪素培养基：牛肉膏0.3g,Nacl0.5g，酪素1.0g，琼脂2.0g，蒸馏水100ml，PH7.6-8.0。
产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6.0g，豆饼粉4.0g,Na2HPO40.4g，KH2PO40.03g，
Na2CO30.1g，自来水100ml，PH9.0（灭菌前）。
[2]制备土壤稀释液
称取土样1g，放入盛10ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min，使土样与水充分
混合，将细胞分散，用一支1ml无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水
的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml
无菌水的试管中，充分混匀，以此类推制成10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释
度的土壤溶液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。将
稀释度为10-4,10-5,10-6的试管放入80℃的水浴锅中处理10min,以杀死非芽孢杆菌。
[3]倒平板
将灭过菌的培养基分别倒平板，倒入培养皿大约15ml培养液。
[4]涂布
在每个平板底部分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管
分别由10-4，10-5，10-6三种稀释液各吸取0.2ml，小心的滴在对应的平板培养基表
面中央，右手拿无菌涂布器放在平板培养基表面，将菌悬液沿同心圆方向轻轻的
向外扩散，使之分布均匀，室温下静置5-10min，使菌悬液浸入培养基。
[5]培养
将培养基平板倒置于32℃温室中培养3天。
[6]挑菌落
将培养后长出的单个菌落进行编号，选择表面干燥，粗糙，不透明的菌落，挑取少
许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
2.2纯化
[1]从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，接种酪素斜面培养基，32℃
培养3d,测定平板上菌苔直径和水解圈直径。
[2]菌苔直径和水解圈直径比值小的菌株对应的斜面培养物可以作为进行诱变选
育的菌株。
2.3选育
（1）菌悬液的制备：①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌
块。②用血球计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
（2）平板制作：将琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板18套，凝固后待用。
（3）紫外线处理：①将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于
平皿中。③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，
功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。
（4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-5
（5）涂平板：取10-3、10-4、10-5三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的
菌稀释液涂平板作对照。
（6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
（7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数
及其致死率。
3实验数据与分析
3.1实验结论
3.1.1紫外线诱变结果：
