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口蹄疫O 型灭活疫苗免疫成年羊与羔羊效果作者：郑晓萍来源：《畜牧兽医科学》 2019年第23期郑晓萍（江苏省苏州市吴中区动物卫生监督所，苏州 215000）摘要：依照农业部拟定的口蹄疫免疫流程，有针对性追踪监测散养羊免疫后的抗体水平，进而初步探析口蹄疫O型灭活疫苗免疫接种后抗体水平增长与消退规律。
结果表明，具有一定基础免疫抗体的羔羊初次免疫后1月加强1次，在4月中O型口蹄疫的免疫抗体合格率均达到农业部设定的70%以上，取得的免疫接种效果较明显。
关键词：口蹄疫；口蹄疫O型；灭活疫苗；免疫效果中图分类号：S858.26 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.23.0050 引言口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性、热性、高传染性疾病，偶蹄动物是该病的主要发病群体，目前口蹄疫是世界动物卫生组织（OIE）A类家畜传染病“队列”中占据首位的病症，中国将其列为一类动物传染病。
FMD的表现以口腔黏膜、鼻镜、蹄部和乳房皮肤处有水平与溃烂形成为典型特征。
传染性极强、传播快速、感染率与发病率均处于较高水平等是FMD的主要特征。
FMD可能会引起偶蹄动物大量死亡，使养殖户承受较大的经济损失。
当下针对FMD尚无特效药物治疗，多采用综合防控办法控制FMD疫情，疫苗预防始终是我国主要防治手段，被列为强制免疫项目[1]。
为使畜群免疫抗体水平能在较长时间内维持在有效保护状态中，应科学设定免疫时间与频次，本文对口蹄疫O型灭活疫苗免疫情况进行对比分析，探析抗体消长规律，以更完善免疫方案。
1 材料与方法1.1 试验动物选择某乡镇2个散养户的经产羊与刚初生的羔羊为试验研究对象，严格依照农业部设定的免疫接种流程进行免疫的免疫程序，并针对免疫抗体水平进行追踪监测。
1.2 器材96孔稀释板，微型振荡器，移液枪、加样槽等。
1.3 疫苗口蹄疫O型灭活疫苗生产厂家为兰州兽医研究所。
1.4 检测采样分别监测该乡镇2个散养羊户羊只的免疫抗体，分别在成年羊和羔羊免疫后 1～4月（羔羊初次免疫后1月加强免疫1次）后进行随机抽样检查。
一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。
现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。
1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。
病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。
2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。
灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。
当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。
然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。
中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。
2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。
硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
健康养殖·诊疗畜牧业环境 2021.0286摘 要：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、热性传染性疫病，此病常发生于偶蹄动物，被世界卫生组织列为传染病，又被我国列为一类动物疫病。
文章主要介绍口蹄疫阻断ELISA 抗体检测实验步骤和注意事项，为洛南县生畜养殖场或户的免疫抗体水平做好分析，为口蹄疫抗体监测工作提供依据和参考。
关键词：口蹄疫病毒；O型抗体检测；注意事项；结果分析1 样品来源该实验样品来自于全县16个镇，随机抽取生猪养殖场20个，每场采集血清样品15份；零散养殖户随机抽取16户，每户采集血清样品5份，共计380份。
2 实验仪器量筒、烧杯、离心管架、超纯水机、电热恒温箱、洗板机、酶标分析仪、移液枪头、单道移液器、多道移液器、离心管、一次性洗液皿、一次性吸水纸。
3 洗涤液配制用量筒取900ml蒸溜水或去离子水与100ml洗涤液混合（洗涤液是浓缩洗液，需要稀释），充分混匀即为工作浓度洗涤液。
4 具体实验步骤4.1 实验前的准备工作将阻断ELISA抗体检测试剂盒和待检血清从冷藏和冷冻箱中取出，将待检血清竖行排列于离心管架上，并做好编码，等试剂和血清样品温度恢复到室温20℃～25℃，在进行实验。
4.2 操作步骤4.2.1 加样（1）预先取出包被板，取出样品稀释液，在每孔加入样品稀释液50 µl。
（2）再用10 µl的移液器添加50µl待检样品。
（3）在包被板最后加入50µl阴性和阳性对照品各2孔，盖膜，避光在37℃反应60min。
4.2.2 洗板60min时间到取包被板，揭掉封板膜，倒掉孔内液体，用预先配制好的洗涤液洗涤3次，每次停留1min；最后一次倒干净后，用吸水纸将包被板内液体拍干。
4.2.3 检测（1）在包被板中加酶标结合物（1号液）100µl，盖膜，避光在37℃反应60min。
60min时间到后取出包被板，揭膜，倒掉孔内液体，用预先配制好的洗涤液洗涤3次，每次停留1min；最后一次倒干净后，用吸水纸将包被板内液体拍干。
摘要：为研究两种口蹄疫抗体检测试剂盒的应用适用性，对50份血清分别用口蹄疫液相阻断ELISA 检测试剂盒和固相竞争ELISA 检测试剂盒进行了检测，并比较了两种试剂盒的阳性检出率、特异性、稳定性及检测值与中和抗体的线性关系。
结果表明，两种试剂盒在应用方面各有优劣，口蹄疫固相竞争ELISA 检测试剂盒具有操作简便、耗时短、成本低的优点，更适用于基层兽医实验室进行口蹄疫抗体定性检测；口蹄疫液相阻断ELISA 检测试剂盒可测定血清中的具体抗体效价值，更适用于口蹄疫抗体定量检测。
关键词：口蹄疫O 型、A 型抗体；液相阻断ELISA ；固相竞争ELISA ；检测试剂盒两种口蹄疫O 型、A 型抗体检测试剂盒检测猪口蹄疫抗体的应用研究刘利芳，杨思宇，李撒（郑州中农快检科技有限公司郑州451164）doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.11.049收稿日期：2023-02-16口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus ，FMDV ）引起的人畜共患传染病，是畜间发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。
该病传播迅速，流行面广，成年动物多取良性经过，幼龄动物多因心肌受损而死亡率较高。
本病广泛流行于世界各地，由于本病使动物及其产品流通和国际贸易受到限制，造成了巨大的经济损失，世界动物卫生组织将口蹄疫列为动物A 类传染病，我国《中华人民共和国动物防疫法》将其列为一类疫病[1]。
目前在我国，疫苗免疫是最主要手段。
酶联免疫吸附试验因在口蹄疫检测中具有敏感、特异、稳定、安全、快速、简单易于操作等特点而备受青睐。
本研究利用两种口蹄疫ELISA 检测试剂盒对血清进行检测，研究不同试剂盒的应用情况，以期选择更简便准确的方法用于大规模检测，以便做好口蹄疫防治工作，也有利于试剂盒的不断改进。
1材料与方法1.1材料1.1.1血清样品1）四份已知中和抗体效价的猪口蹄疫O 型血清，编号N 为9号、10号、11号、17号。
资金项目：山东省农科院农业科技创新工程项目“畜禽重要疫病防控关键技术（CXGC2016B14）”；山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（SDAIT-08-17）。
作者简介：李玲（1983—），女，助理研究员,硕士，研究方向为畜禽疫病防控与生物制品研发。
*通讯作者口蹄疫O型抗体ELISA检测血清稀释方法优化比较李玲1,魏凤2,郝胜楠3,吕素芳2,李峰2*（1.山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600;2.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州;3.东营市河口区畜牧业发展服务中心山东东营257200）试验选择液相阻断ELISA检测试剂盒，对20份血清样品检测口蹄疫O型抗体。
试验比较了1:8起始稀释8个梯度，1:16起始稀释4个梯度，1:32起始稀释4个梯度，1:64起始稀释4个梯度4种方法抗体效价测定结果，其阳性率分别为70%、65%、70%、70%，组间差异不显著。
提出了针对不同检测需求，合理选择血清稀释方法的建议，有助于指导临床应用。
蹄疫；O型抗体；血清；稀释方法口蹄疫（FMD）具有传染性强、传播速度快、感染动物种类多等特点[1]，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
我国制定实施了“国家口蹄疫防治计划”（2016—2020年），对O型口蹄疫，采取分阶段、分区域控制策略[2]。
2020年国家动物疫病强制免疫计划，要求口蹄疫的群体免疫密度应常年保持在90%以上,免疫抗体合格率全年保持在70%以上[3]。
此外，农业农村部明确对跨省调运乳用种用动物需依据“口蹄疫防治技术规范”等开展口蹄疫抗体检测[4]。
因此，牛、羊、猪口蹄疫抗体检测已成为基层常规检测项目，其中以液相阻断ELISA方法应用较多，李小明等[5]研究表明该方法灵敏性和特异性高，重复性好，结果判定科学且不受检验人员主观性影响。
我们在该方法检测口蹄疫O型抗体时，选择不同的血清稀释方法，并就其结果差异性进行了比较，旨在根据检测对象与检测目的，选择合适的血清稀释方法，实现提高检测效率、节约实验室资源的目的。
2015年第1期浙江畜牧兽医欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍表3副猪嗜血杆菌西药药敏试验结果药物耐药中敏高敏抑菌圈直径环丙沙星1516－202126氧氟沙星1011－151632头孢哌酮1516－202136复方新诺明1011－151611林可霉素1415－20210诺氟沙星1516－181924青霉素1920－27280链霉素1112－14150庆大霉素1213－141521Hps 血清型较多，目前报道有15种，不同菌株对同一种抗生素的敏感性存在很大差异，临床治疗应结合分离菌株的药敏试验结果，科学用药。
3小结与讨论本试验通过对疑似发病猪场采集患猪病料，并进行病原菌分离鉴定、动物试验，鉴定为副猪嗜血杆菌。
通过药敏试验，确诊分离菌对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢哌酮高敏，复方新诺明中敏，青霉素、链霉素、林可霉素耐药；对金银花及其组成的复方敏感，且复方作用效果优于单方［9］。
副猪嗜血杆菌病临床治疗上中药建议使用金银花及其组成复方，西药建议使用庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢哌酮。
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经检测，2412份样品中规模奶牛场牛群免疫抗体滴度≤1ʒ64样品42份，抗体滴度≥1ʒ128样品2370份，抗体保护率为98%。
关键词：液相阻断ELISA ；O 型口蹄疫；抗体检测；奶牛中图分类号：S858．23文献标识码：A 文章编号：1005－7307（2015）01－0003－003口蹄疫属我国农业部公布的一类动物疫病，是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以牛，猪最易感，羊、骆驼、象等均有发病报告。
该病可分为O 、A 、C 、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南Ⅲ型和亚洲Ⅰ型等7个血清型，其中以O型和A 型分布最广，危害最大。
本试验应用液相阻断ELISA 检测方法跟踪检测上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场O 型口蹄疫疫苗免疫抗体滴度水平，以利及时指导下属牧3浙江畜牧兽医2015年第1期场O型口蹄疫防疫工作，为牧场健康发展提供有效保障。
现将检测应用情况报告如下。
1材料与方法1．1检测样品上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场牛群经口蹄疫O型灭活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫的奶牛血清样品2412份。
1．2实验器材酶标仪、37ħ恒温温箱；5．0 50．0μL移液器、50．0 200．0μL移液器及50．0 300．0μL12道移液器；配套移液枪尖，移液槽；吸水纸；96孔平底酶标板；96孔U形底聚丙烯微量抗原抗体反应板；检测试剂盒系采用中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒。
1．3实验步骤1．3．1牛群免疫应用口蹄疫O型灭活疫苗按照产品说明书规定免疫剂量及免疫方法对公司下属牧场牛群接种免疫，于2免21d后采血进行免疫效果检测。
1．3．2试剂准备包被缓冲液（pH9．6）、磷酸盐－吐温缓冲液（PBST）、PBST稀释液、底物溶液按试剂盒说明书进行配制。
1．3．3包被pH9．6包被缓冲液稀释口蹄疫O型病毒兔抗血清至工作浓度（1ʒ1000），混合均匀，酶标板上每孔加入50μL，振荡，封板室温过夜，使抗体在pH9．6条件下吸附于酶标板上。
1．3．4抗原抗体反应（对照血清及待检血清）以96孔U型微量血凝板检测，以20份样品为例，需板2块，血清以倍比稀释法进行（注：空白孔为无样品加入）。
A．加PBST稀释。
A1—A10加入150μL PBST 稀释液，B1—B10，C1—C10，D1—D10，E1—E10各加入50μL PBST稀释液。
H1加入150μL PBST稀释液，H2—H10各加入50μL PBST稀释液，A12—B12各加50μL PBST稀释液。
B．加血清稀释。
在A1中加入50μL待检血清样品，混匀后取50μL加入B1，再混匀后取50μL 加入C1连续2倍稀释（从A11ʒ4倍开始稀释到E1 1ʒ64倍，A1—A10共10个样品），直至加到E1混匀，再从E1中吸取50μL弃去。
阳性血清取50μL 加入H1，混匀后取50μL加入到H2，直至加入到H10混匀，再从H10中吸取50μL弃去（从H11ʒ4倍开始稀释到H101ʒ2048倍）。
阴性血清取50μL 加入A12，混匀后取50μL加入B12，混匀后取50μL弃去。
C．加病毒抗原。
口蹄疫O型病毒抗原用PBST 稀释液稀释到工作浓度（1ʒ12，即1份病毒抗原加11份PBST），96孔U型微量血凝板中待检样品血清及阴阳性血清每孔加50μL，加入等量工作浓度的病毒抗原后，血清稀释度加倍。
E12—H12四个对照孔各加100μL稀释至工作浓度的病毒抗原。
振荡，盖膜封板，2 8ħ过夜（详见图1）。
A B C D E F G H1234567891011 121ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ8－1ʒ4 1ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ8 1ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ128+1ʒ81ʒ161ʒ321ʒ641ʒ1281ʒ2561ʒ5121ʒ10241ʒ2048病毒抗原对照图196孔U型微量血凝板10份血清加入工作浓度病毒抗原后的浓度表1．3．5洗酶标板及抗原抗体转移先将2块抗原抗体反应板从4ħ中取出室温放置，用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从反应板上按次序转移至酶标板上的对应孔，每孔加50μL，封板，37ħ温育60min（详见图2）。
1．3．6洗酶标板及加豚鼠抗血清用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，用豚鼠抗血清稀释液将口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清稀释至工作浓度（1ʒ1000），每孔加50μL，封板，37ħ温育60min。
42015年第1期浙江畜牧兽医A B C D E F G H123456789101112 S11ʒ16S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1ʒ16－1ʒ4 S11ʒ321ʒ32－1ʒ8 S11ʒ641ʒ64空白S41ʒ1281ʒ128空白S111ʒ16S12S13S14S15S16S17S18S19S201ʒ256S111ʒ321ʒ512S111ʒ641ʒ1024S111ʒ1281ʒ2048病毒抗原对照图296孔酶标板检测20份样品布局图1．3．7洗酶标板及加辣根过氧化物酶用PBST 稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，用PBST 稀释液将兔抗豚鼠IgG—辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度（1ʒ500），每孔加50μL，封板，37ħ温育60min。
1．3．8洗酶标板及加底物溶液用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，加50μL底物溶液（底物溶液每1mL加10μL3%双氧水），封板，37ħ温育15min。
1．3．9加终止液15min后，每孔加50μL终止液终止反应，在酶标仪上读取D492nm值。
1．4实验结果判定1．4．1实验认可标准每板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度，与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔，50．0μL/孔，病毒抗原对照D492nm值应在1．5ʃ0．5范围内。
阳性对照抗体效价应在（1ʒ1024）ʃ1滴度内，阴性对照血清抗体效价应＜1ʒ8。
病毒抗原对照平均D492nm值50．00%计算（临界值），抗原对照4孔，弃去最高和最低D492nm OD值，计算剩余2孔的平均D492nm值，除2，即50．00%对照值。
该值即为临界值，表示阻断50．00%反应的对照D492nm值。
1．4．2结果判定标准以病毒抗原对照平均D492 nm值的50．00%为临界值，被检血清稀释孔D492 nm值＞临界值的孔为阴性孔，≤临界值的孔为阳性孔，阳性孔的D492nm值=临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。
2结果与分析2．1病毒抗原对照D492nm值2412份检测血清样品，共采用121个ELISA板，484个病毒抗原对照D492nm值在1．1 2．0范围内。
2．2阴、阳性对照血清抗体效价121个牛群检测血清样品ELISA板临界值均在对应板阳性对照血清1ʒ1024ʃ1滴度的D492nm值内，121个阴性对照血清样品1ʒ8处滴度的D492nm值均≥相应板的临界值相。
