插入突变克隆讲义

《基因突变》讲义一、什么是基因突变基因突变，简单来说，就是指基因在结构上发生了碱基对组成或排列顺序的改变。

我们每个人的身体都是由无数个细胞组成的，而在每个细胞的细胞核中，都存在着携带遗传信息的染色体。

染色体由 DNA 组成，DNA 则是由一个个碱基对按照特定的顺序排列而成。

就好像是一本长长的密码书，碱基对的排列顺序决定了生命的各种特征和功能。

当这本“密码书”中的某些碱基对发生了变化，比如增添、缺失或者替换，就会导致基因发生突变。

基因突变可以发生在生殖细胞中，也可以发生在体细胞中。

二、基因突变的原因基因突变的产生，往往有着多种原因。

首先，自然环境中的一些因素可能导致基因突变。

例如，紫外线、X 射线等各种辐射，它们能够直接损伤 DNA 分子的结构，从而引发基因突变。

还有一些化学物质，像亚硝酸盐、黄曲霉素等，它们能够与DNA 发生反应，改变碱基对的组成和排列。

其次，生物体内自身的一些因素也可能引起基因突变。

在 DNA 复制的过程中，偶尔会出现错误，导致碱基对的配对不正确。

另外，细胞内的一些代谢产物或者活性氧分子，也有可能对 DNA 造成损伤。

此外，病毒的感染也可能导致基因突变。

病毒在侵入细胞后，其遗传物质可能会整合到宿主细胞的染色体中，从而引起基因结构的改变。

三、基因突变的类型基因突变的类型多种多样。

点突变是其中比较常见的一种类型，也就是单个碱基对的替换、增添或者缺失。

比如说，原本的碱基对是 AT，变成了 GC，这就是碱基对的替换。

还有一种是缺失突变，比如一段DNA 序列中的几个碱基对不见了。

插入突变则是在原本的 DNA 序列中插入了新的碱基对。

此外，染色体结构的变异也属于基因突变的范畴，比如染色体的缺失、重复、倒位和易位等。

四、基因突变的特点基因突变具有一些显著的特点。

首先是随机性。

基因突变可以发生在生物体发育的任何时期，也可以发生在细胞内的任何一个基因上。

其次是低频性。

在自然状态下，基因突变的频率通常是很低的。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法主要分为以下几个步骤：
1. 基因突变体的诱导：通过物理、化学或生物诱变剂处理靶基因，以产生所需的突变。

这些诱变剂可以包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。

2. 突变体的筛选：通过表型筛选或DNA测序，从处理过的基因中找出突变的个体。

表型筛选是通过观察表型变化来挑选突变体，而DNA测序则是直接对基因序列进行分析。

3. 突变基因的克隆：使用PCR（聚合酶链式反应）或基因文库技术，将突变基因从基因组中扩增出来。

这一步需要用到特定的引物或探针，以便准确地识别和扩增目标基因。

4. 克隆的验证：通过DNA测序等技术，对克隆的基因进行验证，确保其与原始突变基因一致。

5. 表达载体构建：将克隆的突变基因插入到表达载体中，以便在宿主细胞中进行表达。

这一步通常涉及到载体DNA和目的DNA的酶切、连接和转化等操作。

6. 表达和功能分析：将构建的表达载体转染到适当的宿主细胞中，进行表达和功能分析。

这一步可以包括对表达产物的检测、对细胞表型的影响等方面的研究。

7. 突变基因的应用：根据研究结果，将突变基因应用于相关的生物工程或医学研究中。

例如，可以用于研究基因功能、开发新药物或改良农作物等。

克隆突变基因的方法涉及多个技术领域，如分子生物学、生物化学和遗传学等。

这些技术的不断发展和改进，使得我们能够更快速、更准确地鉴定和克隆突变基因，为相关研究提供有力支持。

拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定摘要利用T-DNA插入拟南芥基因引起突变，获得突变植株，提取16号植株细胞DNA，利用三引物法进行PCR扩增，检测得16号植株细胞内原基因与插入突变基因同时存在，为杂合突变体。

引言反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。

经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。

反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。

与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。

T-DNA插入突变技术T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。

T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

植物材料——拟南芥拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：(1)植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；(2)生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；(3)自花授粉，有助于遗传试验的人工控制；(4)种子多，每株每代可产生数千粒种子；(5)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；(6)基因组小，只有5对染色体。

插入诱变在拟南芥基因克隆中的应用摘要随着各种基因克隆方法的建立,克隆的拟南芥基因越来越多,其中转座子标签和T-DNA插入诱变克隆的拟南芥基因的数目最多,插入诱变已成为克隆和鉴定很多重要植物基因的方法。

突变体在农业发展中起着重要作用,如苹果、玫瑰等许多园艺植物品种就是自然突变(芽变)经无性繁殖产生的。

人们一直利用物理或化学诱变剂诱使植物大量变异,获得植株突变体。

植物学家也利用这些突变体鉴定与克隆目的基因。

插入诱变剂包括转移DNA(T-DNAs)和转座成分(转座子),是植物分子生物学家克隆基因最普遍使用的诱变剂,这些诱变剂既能使基因失活,又可重获植物基因组DNA,这个过程就是众所周知的基因标签,它不但能验证突变的目的基因对植物生物化学与发育过程的重要性,而且克隆相关基因的方法较为简便,不需了解目的基因产物或在基因组中位置。

本文讨论插入诱变及拟南芥突变体基因的克隆。

1拟南芥遗传特性与烟草等易于基因标签的物种比,拟南芥更适合于植物遗传研究。

拟南芥矮小(株高为25~40cm),不需太大的生长空间;生长间期短(6~7周);自花授粉;结实率高(每株有5000~10000粒种子)等特性都有利于遗传分析。

最重要的是,拟南芥基因组较小(120000kb)和少量分散的重复DNA有利于功能基因的标签,分离基因的工作量少。

另外,拟南芥是一种开花植物,具有典型的植物细胞生理和发育过程,通常可假定拟南芥基因在其它大部分高等植物上具有相似的功能。

2T-DNAs在拟南芥基因克隆中的应用土壤根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefacien)的转移DNA的T-DNA,是Ti质粒上能够诱导肿瘤的DNA片断。

片断两端为25bp 的边界重复序列,当农杆菌侵染时,该片断转移到植物细胞并整合进基因组中。

该过程能否诱导突变,插入T-DNA中的基因和突变体共分离,要看T-DNA整合到基因组中的位置(基因或非编码的DNA中)。

T-DNA插入诱变在拟南芥(Arabidopsis)中应用最为成功,在已报道的20000多转化体中克隆了20多个基因。