2016-赵卓-土壤中产淀粉酶菌株的分离、筛选和初步鉴定

题目产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种摘要首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，筛选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方法，从发酵培养基三个主要成分（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多相分类的方法对筛选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确定为短芽孢杆菌。

引言淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[1]。

现在淀粉酶主要来源于植物和微生物[2]并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事[3]。

本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。

一、研究方法1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。

诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计：3、培养基和试剂（1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基[4、7]、出发培养基[4、7]、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2 、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸（注：所用药品均为分析纯）。

4、实验方法（1）细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的H/C值[5]。

大理学院学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY 第12卷第10期2013年10月Vol.12No.10Oct.2013［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2013.10.011α-淀粉酶（α-amylase），编号：EC3.2.1.1，作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，是一种只能催化水解直链淀粉的液化酶〔1〕。

通常采用酶活力（enzyme activity）来表示酶催化一定化学反应的能力〔2〕。

一般情况下，α-淀粉酶的作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH值范围5.5~7.0，最适pH值为6.0。

α-淀粉酶主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。

α-淀粉酶酶制剂大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，占酶制剂市场份额的25%左右〔3-4〕。

目前，工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶，最常用的方法是从自然界中筛选出可以产这种酶的目的菌种，大致可以分为以下4个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定〔5-6〕。

土壤是微生物生活的大本营，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到期望中的菌株，再对菌株进行发酵培养，生产出所需的酶〔7〕。

由于我国的α-淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α-淀粉酶酶活力相对于国外同行业的较低〔8〕。

本研究旨在从富含淀粉类物质的土壤中分离纯化出产α-淀粉酶的菌株，通过水解圈直径和菌落直径的比值，结合酶活力大小进行比较，筛选出产酶活力较强的菌株，并对其所产的酶进行初步的酶学性质研究。

研究结果可为α-淀粉酶的生产提供种质资源，同时也为生产实践提供数据支持和理论参考。

1材料土壤中产α-淀粉酶菌株的分离和筛选杨杨，刘毕琴，张发，廖光辉，杨晓燕*（大理学院农学与生物科学学院，云南大理671003）［摘要］目的：从土壤中筛选产α-淀粉酶活力较强的菌株并对其酶学性质进行初步研究。

土壤样品淀粉酶产淀粉酶的筛选与鉴定
土壤中的淀粉酶主要是由微生物产生的，筛选和鉴定方法如下：
1. 筛选淀粉酶高产微生物。

首先需要从土壤中分离出微生物，然后通过对微生物的单菌培养和筛选，从中选出淀粉酶高产菌株。

2. 鉴定淀粉酶高产微生物。

对于筛选出来的淀粉酶高产菌株，需要通过生理学和生化特征进行鉴定，确定其种属和鉴定相关酶的产生情况。

3. 确定淀粉酶活性。

通过对筛选出来的淀粉酶高产菌株进行淀粉酶活性测试，确定其淀粉酶的活性水平。

4. 优化淀粉酶产酶条件。

针对筛选出来的淀粉酶高产菌株，需要进行酶产条件的优化，包括酸碱度、温度、培养基成分、培养时间等方面。

5. 应用淀粉酶。

将优化后的淀粉酶高产菌株应用于实际生产中，如工业制造、生物学研究等领域。

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选组数：第一组组员：王臣东李长花张晓晶杨明明1 实验目的1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。

1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。

1.3掌握分离纯化微生物的方法。

1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。

1.5巩固以前学的微生物学实验技术。

1.6学习淀粉酶活性的测定方法。

2 实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。

淀粉酶是能够催化淀粉水解，转化成葡萄糖的、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称。

从淀粉厂周围采集土壤样品，采用稀释法制备土壤稀释液，涂布于营养琼脂培养基平板上培养1天，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。

然后挑取可产生透明圈的菌株在平板划线培养2-3次，得到纯化的菌株，再测其酶活力大小。

分离得到纯种这只是选种工作的第一步。

所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。

性能测定的方法分初筛和复筛两种。

初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。

例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。

复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。

一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。

在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。

3 实验器材3.1样品：土样（甘肃昆仑生化公司周围采集的土样若干）3.2培养基3.2.1平板培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、琼脂15-20g、自来水1000ml3.2.2斜面培养基：同3.2.13.2.3液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、自来水1000ml3.3 器材：30个90培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台3.4试剂3.4.1 淀粉酶活力测定：碘液3.4.2革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇3.4.3 2%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml4 实验步骤4.1 培养基的制备及其仪器的灭菌4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。

2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。

3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。

二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。

3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。

2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。

微生物学实验设计方案实验名称：土壤中分离产生α-淀粉酶的菌种一．实验目的1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。

2、学习、掌握微生物的鉴定方法。

3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定4、对简单鉴定后的微生物进行生理生化鉴定并由鉴定结果查伯杰氏手册以确定分离出微生物的品种。

二. 实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。

从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。

1、采样：即采集含菌的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。

在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。

在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。

除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。

例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。

2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。

因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。

3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。

通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。

纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。

三．实验材料1、器材：小铁铲和无菌纸或袋、培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管（每支4.5mL水）、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、搪瓷杯、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、天平、滤纸、pH试纸等。

“产淀粉酶菌株的筛选”设计⽅案产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选⼀、实验⽬的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微⽣物的完整操作步骤。

2.巩固以前所学的微⽣物学实验技术。

3.学习淀粉酶活性的测定⽅法。

⼆、实验原理：1.α-淀粉酶是⼀种液化型淀粉酶，它的产⽣菌芽孢杆菌，⼴泛分布于⾃然界，尤其是在含有淀粉类物质的⼟壤等样品中。

2.从⾃然界筛选菌种的具体做法，⼤致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。

a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究⼀下⾃⼰打算筛选的微⽣物在哪些地⽅分布最多，然后才可着⼿做各项具体⼯作。

在⼟壤中⼏乎各种微⽣物都可以找到，因⽽⼟壤可说是微⽣物的⼤本营。

例如厨房⼟壤、⾯粉加⼯⼚和菜园⼟壤中淀粉的分解菌较多。

b)富集培养：富集培养就是在所采集的⼟壤等含菌样品中加⼊某些物质，并创造⼀些有利于待分离微⽣物⽣长的其他条件，使能分解利⽤这类物质的微⽣物⼤量繁殖，从⽽便于我们从其中分离到这类微⽣物。

c)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使⽤选择培养基对菌种进⾏培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出⽬的菌种，从⽽进⾏培养。

ii.（鉴别培养基）初筛利⽤鉴别培养基，通过添加⼀些特殊的试剂或成分来鉴别出⽬的菌种，从⽽筛选出来并对其进⾏培养。

d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的⽬的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从⽽得到纯种的菌落。

纯种分离的⽅法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢⼦或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。

e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进⾏性能测定后才能决定取舍。

三、实验材料：1.培养基配制：a)培养基按以下⽐例配制后，加蒸馏⽔调⾄100%；b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋⽩胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、琼脂粉0.8%、⽜⾁膏0.5%、pH7.0；c)分离培养基：⽟⽶粉2%、黄⾖饼粉1.5%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加⼊）、Na2HPO40.2%、pH7.0。

土壤中含淀粉酶细菌的分离摘要本文研究了从土壤中分离含淀粉酶的细菌，并对细菌的生长进行了探究。

首先制备两组土壤稀释液，其稀释度从10-2 —10-6，其中一组经过高温灭菌。

然后，利用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离纯化该细菌于相应变好的无菌培养皿内，同时倾倒含有淀粉的琼脂培养基约3-5mm。

待平板冷凝后，倒置于恒温箱中培养。

实验发现不同菌悬液稀释度对细菌菌落的形成没有严格的比例关系。

但是，加热处理可显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例。

最后经过微生物的分离，纯化及鉴定，选定透明圈较大的细菌菌落为淀粉酶活性较高的菌株。

[关键词]：土壤微生物；稀释液；菌种分离；高温灭菌；淀粉酶；前言土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此，土壤是微生物多样性的的重要场所，也是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化出许多有价值的微生物。

近几十年来，研究工作者对土壤微生物开展多方面的研究，取得了许多可喜的成就，并被广泛用于生产和生活中。

本研究是从土壤中筛选可产生淀粉酶细菌为目的，利用物理和化学方法探究稀释度对细菌菌落形成的影响，以及用不同的处理方式反映出高温加热对含有高活性淀粉酶细菌的比例产生的影响。

从实验研究的结果可以为工业化大规模生产含淀粉酶微生物及制备酶制剂等领域提供重要的帮助。

2、材料与方法2.1 材料称量纸，棉塞，搪瓷缸（1000ml），电炉2.1.1 培养基配制的材料与试剂土豆60克、葡萄糖6克、淀粉3克、琼脂粉6克2.1.2 玻璃器皿圆底培养皿（10个）、量筒（100ml）、移液管两支（1ml）、试管（10支）、大三角瓶（500ml）、小三角瓶（250ml）、玻璃珠（20粒）、大烧杯。

2.1.3样品实验室预先准备好土壤25克2.2 方法2.2.1 培养基制备（一）称量根据用量按比例向滤液中加葡萄糖6克，加淀粉3克，加琼脂粉6克（边加边搅拌）。

然后将滤液置于电炉上熔化，熔化过程中需不断搅拌，当滤液熔化完全后，补足所需水分，定容至300ml。

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定与淀粉酶活的测定摘要：从饭堂门口和生化楼楼下的土壤中分离、纯化、培养获得七个菌株，其中五个为能分泌淀粉的芽孢杆菌，通过一系列生理生化实验，对其中两个菌株的种属进行了初步鉴定，并对其中一株菌所产的淀粉酶活力进行了测定。

关键字：土壤芽孢杆菌淀粉酶鉴定活力土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用,它推动着生态系统的能量流动和物质循环,维持生态系统的正常运转,是生态系统中的重要组成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和气候等综合因素对微生物的影响和作用,同时其生命活动也反映出土壤肥力、土壤改良与植物营养的密切关系。

芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一,也是土壤细菌的主要种群之一。

本实验通过小组合作，由老师指导，小组自行设计、进行实验，对土壤微生物进行分离、纯化与鉴定，发酵与产物测定，对学生的实验能力进行一个比较全方面的锻炼和培养。

（1）了解微生物分离纯化的原理与微生物分离纯化常用方法和技术；（2）掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理与方法；（3）掌握微生物的摇瓶培养方法与淀粉酶活力测定的原理与方法；（4）培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题与判断实验结果的能力；（5）对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；（6）从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力与总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。

1.原理与方法概述1.1原理1.1.1芽孢杆菌1.1.1.1形态学特性：芽孢杆菌细胞呈直杆状，0.5-2.5μm×1.2-10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。

细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。

芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。

1.1.1.2生理学特性：芽孢杆菌属，革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。

多数为腐生菌,主要分布于土壤、动植物体表与水体中。

该属细菌的重要生理特性是能够产生对对热、pH和盐各种多样性的不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。