苏云金杆菌摇瓶发酵培养基

苏云金杆菌发酵培养基研究进展张培培;徐健【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2014(000)015【摘要】苏云金杆菌前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，本文综述了苏云金杆菌发酵研究所用的培养基的类型，包括传统发酵原料、城市污泥、工业废液、蓝藻、废弃物等及其特点，为企业选择适合的原料和工艺提供了借鉴作用，并对苏云金杆菌发酵培养基的研究进行了展望。

%Bacillus thuringiensis was a microbial insecticide which was most versatile and had the largestyield .The types, characteristics of culture medium of Bacillus thuringiensis fermentation were reviewed , including traditional fermentation raw material , city sludge , industrial waste , cyanobacteria , and waste , to provide the reference of raw materials and process for theenterprise.Bacillus thuringiensis fermentation medium was also discussed.【总页数】3页(P31-33)【作者】张培培;徐健【作者单位】扬州工业职业技术学院化学工程学院，江苏扬州 225127;扬州绿源生物化工有限公司，江苏扬州 225008【正文语种】中文【中图分类】TQ458【相关文献】1.苏云金杆菌低成本固体发酵培养基的研制 [J], 刘云飞;宁文烁;陆秀君;李瑞军;郭巍2.新疆苏云金杆菌35高效菌株液体深层发酵培养基的筛选 [J], 史应武;赵思峰;李国英3.苏云金杆菌液态发酵培养基的优化 [J], 廖湘萍;付三乔;易华蓉;杨翠珍4.苏云金杆菌Bt0601菌株发酵培养基的优化 [J], 陈宇;王立和;侯雁平;莫湘涛;付祖姣;夏立秋5.响应面法优化苏云金杆菌固态发酵培养基 [J], 杨超英;陶玉贵;徐先炉;叶连斌;汪耀明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化运用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理，以最陡爬坡实验得到的中心点对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验确定的３个显著性影响因子各取３水平．设计了３因素３水平共１５个实验点进行响应面分析．１．５芽孢量测定用石碳酸复红对待测菌液进行染色，芽孢未被染色，在显微镜下观察，血球计数板进行计数．２结果与分析２．１单因子实验２．１．１碳源单因子实验分别以玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养，结果表明５种碳源都能促进该菌的生长并产生芽孢．其中以玉米淀粉为碳源的培养基芽孢产量最多，结果见图１．从培养基原料的来源、价格和对芽孢产量的影响等方面考虑，确定以玉米粉、玉米淀粉作为发酵培养基的碳源．２．１．２氮源单因子实验以玉米淀粉作为碳源，分别以黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、黄豆粉作为初始氮源，进行单因子实验．在培养过程中苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９生长良好，各种培养基组合都有芽孢产生，但在芽孢产量上有所差别，结果如图２所示．可见酵母粉对芽孢的产量影响最大，本实验确定以酵母粉、黄豆饼粉作为培养基的氮源．２．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法筛选培养基巾影响发酵液芽孢产量的重要因子通过碳源和氮源单因子实验，结合其他召ｚ发酵实验过程中发酵培养基的组成以及碳氮源比例，确定初始发酵培养基为：玉米粉１０．０ｇ／Ｌ，玉米淀粉１５．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２０．０ｇ／Ｌ，酵母粉３．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。

·７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ。

０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ。

０．２ｇ／Ｌ．将初始发酵培养基巾的８个组分作为影响因素进行全面考察，选择８因子２水平的实图１不同碳源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响图２不同氮源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响验设计，以ｘ。

、咒、ｘ。

、Ｘ。

、ｘ，、ｘ。

、ｘ。

、ｘ。

分别代表玉米粉、玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、Ｋ：ＨＰＯ。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011525927.9(22)申请日 2020.12.22(71)申请人 武汉科诺生物科技股份有限公司地址 430074 湖北省武汉市东湖开发区关南工业园(72)发明人 王猛　胡虓　万俊　黄芳　熊圆圆　夏建荣　张晓明　龚永华　徐广　霍瑞　刘守德　(74)专利代理机构 武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙) 42231代理人 徐绍新(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 1/04(2006.01)C12R 1/07(2006.01)(54)发明名称一种苏云金芽孢杆菌液体发酵培养基及发酵培养方法(57)摘要本发明公开了一种防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌JQ23的液体发酵培养方法，该方法所使用的发酵培养基配方为葡萄糖30‑50g/L，黄豆饼粉25‑35g/L，花生粕5‑15g/L，蛋白胨10‑30g/L，酵母粉2‑5g/L，磷酸二氢钾0.2‑0.5g/L，硫酸铵0.2‑0.5g/L，氯化钙0.1‑0.3g/L，氯化锰0.01‑0.05g/L，其余为无菌水。

本发明培养的苏云金芽孢杆菌芽孢含量可达8.25×109cfu/mL，对2龄韭蛆幼虫3天的校正死亡率可达93％，且杂菌含量低，发酵液制备的悬浮剂常温下放置性能稳定，便于长途运输和长期保存。

权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 112501083 A 2021.03.16C N 112501083A1.一种苏云金芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，该方法包括使用培养基对苏云金芽孢杆菌种子液进行发酵培养的步骤，所述培养基的配方如下：葡萄糖30‑50g/L，黄豆饼粉25‑35g/L，花生粕5‑15g/L，蛋白胨10‑30g/L，酵母粉2‑5g/L，磷酸二氢钾0.2‑0.5g/L，硫酸铵0.2‑0.5g/L，氯化钙0.1‑0.3g/L，氯化锰0.01‑0.05g/L，其余为无菌水。

苏云金杆菌7216菌株的摇瓶发酵试验
金玉来
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】1994(24)3
【摘要】用苏云金杆菌发酵生产的杀虫剂是一种不污染环境,对人畜无毒,能有效防治鳞翅目农林害虫的细菌农药,目前已有14个血清型、19个以上的变种,其产毒部分主要是δ-内毒素即伴孢晶体和芽孢。

作为蔬菜无公害生产的技术措施,我国应用杀虫菌剂综合防治蔬菜害虫取得了较大进展,其中细菌农药的发酵即应用苏云金杆菌7216、HD-1等优良菌株,为使其工艺控制符合发酵生产的要求,达到菌数多、毒力高、周期短、成本低等综合指标,我们对7216进行了摇瓶发酵试验,研究不同培养条件下的呼吸作用、生长繁殖、营养利用及伴孢晶体和芽孢的形成,为工业发酵生产提供科学依据。

【总页数】6页(P35-40)
【作者】金玉来
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】TQ453.5
【相关文献】
1.苏云金杆菌摇瓶发酵培养基 [J], 黄天培;邱思鑫;黄志鹏;黄必旺;关雄
2.抗菌海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1-2菌株摇瓶发酵培养基和发酵条件优化 [J], 汪
晶晶;曹雪梅;李欢;暴增海;马桂珍;贾杰;王淑芳;罗志会
3.苏云金杆菌摇瓶发酵工艺与工程参数 [J], 范代娣;俞俊棠
4.L—赖氨酸产生菌FH128菌株的研究：（Ⅰ）FH菌株的选育及摇瓶发酵 [J], 富英华;苏令呜
5.酸奶弱后酸化菌株摇瓶增菌工艺及发酵罐扩培试验 [J], 赵丽娜;巩俊明;张娜;李晨;田洪涛;王妙姝;康红艳;罗云波
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2000年2月第30卷第1期 西北大学学报(自然科学版)Journal of N o rthw est U niversity (N atural Science Editi on ) Feb .2000V o l .30N o.1 收稿日期:1999209214 基金项目:陕西省科技攻关项目(97K 032J 6) 作者简介:申烨华(19642),女,陕西延安人,西北大学博士生,从事生物大分子分离与纯化研究。

苏云金杆菌发酵培养基的研究申烨华1,孙 2,张粉艳2,李宝璋2(1.西北大学现代分离科学研究所;2.西北大学化学工程学系,陕西西安,710069)摘要:采用正交实验法研究了不同培养基对B t 2HD 1产毒能力的影响。

优选出的培养基为:发酵液芽孢数达511×109・mL -1,2%发酵液24h 致死3龄小菜蛾幼虫65%,48h 达89%,72h 达100%。

普通培养基对应值分别为6.0×108・mL -1和35%,83%,100%。

优选出培养基最佳碳氮比(C N )为2.0,最佳含固量为8%。

关　键　词:正交实验;苏云金杆菌;培养基中图分类号:Q 815 文献标识码:A 文章编号:10002274 (2000)0120032204 B t 菌发酵生产的杀虫剂是一种对环境无污染,对人畜无毒害,害虫难以产生抗药性,不杀灭害虫天敌,从而能有效防治鳞翅目农林害虫,粮贮害虫以及卫生害虫的微生物农药[1],有极良好的应用前景。

在B t 生产中,培养基成分、碳氮比(C N )及含固量对菌的芽孢数量和发酵终产物的杀虫活性即毒力有较大的影响[1]。

关于B t 菌培养基的研究已有很多[2,3,4],但是综合考虑碳源、氮源、C N 和含固量的工作未见报道。

因此,本实验采用正交实验法,综合研究了这些因素对B t 2HD 21产毒能力的影响,得出了B t 2HD 21菌株的优化培养基配方,为B t 2HD 21的生产提供必要的参考。

苏云金芽孢杆菌培养基优化及间歇发酵
关雄;陈锦权
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1998(014)001
【摘要】对苏云金芽孢杆菌的培养基配方进行室内摇瓶优化筛选，首先用摇瓶培养筛选到Ⅱ号培养基，在此配方的基础上，将培养基组分划分为氨源、碳源及无机盐三因素，采用三因素二水平正交旋转组合设计的方法进行培养基优化组合研究，建立其芽孢产量依氨源、碳源、无机盐的呼应方面方程。

借助此方程获得响应最佳点即培养基各组分的最佳配比。

实验结果表明，该方法也苏云金芽孢杆菌培养基优化中十分简便、实用、快速的途径。

此外，对其间歇发酵
【总页数】6页(P75-80)
【作者】关雄;陈锦权
【作者单位】福建农业大学;福建农业大学
【正文语种】中文
【中图分类】TQ45
【相关文献】
1.苏云金芽孢杆菌A322菌株发酵培养基和发酵条件的优化 [J], 张路路;朱朝华;郭刚
2.苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化 [J], 孙翠霞;弓爱君;姚伟芳;邱丽娜;曹艳秋
3.苏云金芽孢杆菌BtR05菌株发酵培养基的优化 [J], 王贻莲;赵晓燕;李红梅;魏艳
丽;李纪顺;杨合同
4.苏云金芽孢杆菌LLB19发酵培养基的优化 [J], 杨梅;张峰;苏新华
5.响应面分析法优化苏云金芽孢杆菌BRC-ZQL3菌株发酵培养基 [J], 张群林;张志国;余洁;林群新;吴小凤;关雄
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苏云金杆菌粉剂发酵工艺一、引言随着人们对健康的重视和对安全、绿色食品的需求不断增加，生物农药逐渐成为农业生产的主流。

其中，苏云金杆菌粉剂作为一种重要的生物农药，具有广谱、高效、低毒等优点，在防治农作物病虫害方面起到了重要的作用。

本文将对苏云金杆菌粉剂的发酵工艺进行深入探讨。

二、苏云金杆菌粉剂的发酵工艺2.1 苏云金杆菌苏云金杆菌（Pseudomonas putida）是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤和水体中。

这种细菌能够分解多种有机物，对农作物病害有很好的防治效果。

2.2 发酵工艺的重要性苏云金杆菌粉剂的发酵工艺是生产高质量、高效生物农药的关键环节。

通过优化发酵工艺，可以提高苏云金杆菌粉剂的发酵产量和质量，并降低生产成本。

2.3 发酵工艺的基本步骤苏云金杆菌粉剂的发酵工艺主要包括以下几个步骤：2.3.1 菌种培养苏云金杆菌的菌种是发酵生产的基础，菌种的良好培养能够保证发酵过程的顺利进行。

一般来说，使用已经培养纯化的苏云金杆菌菌种，通过在适宜的培养基上进行预培养，培养至菌液浓度适宜后即可进行发酵。

2.3.2 发酵过程控制发酵过程中，控制温度、pH值、搅拌速度、通气量等参数对于苏云金杆菌生长和代谢产物的合成具有重要影响。

合理控制这些参数可以提高苏云金杆菌的生长速度和产量。

2.3.2.1 温度控制一般情况下，苏云金杆菌的适宜生长温度在25-30摄氏度之间。

通过控制发酵罐的冷却或加热系统，保持发酵液温度的稳定，有利于细菌的生长和代谢产物的积累。

2.3.2.2 pH值控制苏云金杆菌的生长对pH值有一定的要求，一般在6.0-7.0之间。

通过添加酸碱调节剂，调节发酵液的pH值，可以提供一个适宜的环境条件供苏云金杆菌生长。

2.3.2.3 搅拌速度控制搅拌速度对发酵产物的合成也有一定的影响。

适当的搅拌速度可以保持发酵液的均匀混合，有利于苏云金杆菌的生长和代谢产物的积累。

2.3.2.4 通气量控制苏云金杆菌属于好氧菌，因此通气量的控制对其生长发酵过程至关重要。

苏云金杆菌410718高毒力杀虫菌株发酵条件的研究3丁学知1　夏立秋1　高必达21(湖南师范大学生命科学学院,长沙,410081)2(湖南农业大学植物保护学院,长沙,410128)摘　要　在对苏云金杆菌(B acillus thuringiensis )高毒力杀虫菌株410718产毒单因子培养条件试验的基础上,采用正交设计试验培养和结合杀虫毒力测定的方法,对该菌株产毒的发酵条件进行了研究。

结果表明:在摇瓶发酵培养时,培养基C/N 比为317,发酵起始p H 为718～810,发酵温度为(29±1)℃,150r/min 摇瓶培养43～44h ,接种量为6%～8%时,该突变菌株杀虫毒力与原始菌株相比提高了715倍。

连续传代培养10次,杀虫毒性能稳定遗传。

关键词　苏云金杆菌,发酵条件,产毒,正交实验　第一作者:博士研究生,副教授。

3湖南省中青年科技基金资助项目(No.96-09)　收稿时间:2002-07-05,改回时间:2002-11-06 目前在全球范围内广泛使用的化学杀虫剂,在杀伤害虫的同时,也大量杀伤了害虫天敌,造成了生态平衡的破坏和环境的严重污染,给人类的生命安全带来了巨大威胁。

此外,害虫已逐步对长期使用的化学杀虫剂产生抗药性,形成化学杀虫剂施用的恶性循环。

而生物杀虫剂可部分克服以上缺点,特别是苏云金杆菌(B acill us thuri ngiensis ,简称B t )为目前应用最广、最有效的微生物杀虫剂。

我们利用复合诱变的方法筛选出了B t 高毒力突变菌株410718[1],为了便于工业化大规模发酵生产,降低生产成本,本研究利用一些生产成本低廉的农副产品作为发酵培养基的主要碳氮源,采用正交设计试验结合毒力测定,确定了410718菌株的最佳产毒发酵条件。

本研究为实现苏云金杆菌高毒力杀虫菌株410718的工业化发酵生产提供了重要的依据。

1　材料与方法111　菌　种410718菌株为本室选育获得和保藏(国家菌种保藏号:CCTCC No 1200016)。

苏云金杆菌粉剂发酵工艺苏云金杆菌粉剂发酵工艺一、引言苏云金杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的益生菌，具有广泛的应用价值。

苏云金杆菌粉剂是将苏云金杆菌培养液经过发酵、分离、浓缩等工艺制成的可溶性粉末状产品。

本文将详细介绍苏云金杆菌粉剂的发酵工艺。

二、原料准备1. 苏云金杆菌种子培养基：包括蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分。

2. 发酵培养基：包括蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分。

三、发酵罐消毒1. 清洗发酵罐内壁和附件，使用清水冲洗干净。

2. 使用高温高压蒸汽对发酵罐进行消毒，确保无微生物残留。

3. 将消毒后的发酵罐放置在无菌条件下待用。

四、种子培养1. 将苏云金杆菌种子接入含有苏云金杆菌种子培养基的试管中，进行预培养。

2. 在预培养的基础上，将苏云金杆菌种子接入含有发酵培养基的烧瓶中，进行扩大培养。

3. 在30°C恒温摇床上进行震荡培养，保持适宜的pH和氧气供应。

五、发酵过程1. 将经过扩大培养的苏云金杆菌种子转入发酵罐中，按照一定比例加入发酵培养基。

2. 调整发酵罐内的温度、pH值和氧气供应等条件，以促进苏云金杆菌生长和代谢产物积累。

3. 在一定时间内进行连续搅拌，保持均匀的液体悬浮状态。

六、发酵结束1. 根据苏云金杆菌生长曲线和代谢产物浓度变化情况，确定最佳收获时间点。

2. 关闭搅拌器和通气系统，停止供氧。

3. 将发酵液进行离心分离，得到菌体沉淀和发酵液上清液。

七、菌体处理1. 将菌体沉淀进行洗涤，去除余留的发酵培养基和代谢产物。

2. 使用无菌水进行洗涤，直到洗涤液pH值接近中性。

3. 对洗涤后的菌体沉淀进行浓缩处理，以提高产品的纯度和活性。

八、发酵液处理1. 将发酵液上清液通过过滤器进行初步过滤，去除大颗粒杂质。

2. 使用超滤膜对发酵液上清液进行浓缩处理，去除水分并提高产品浓度。

3. 将浓缩后的发酵液通过喷雾干燥机进行干燥，得到苏云金杆菌粉剂。

九、产品包装1. 对苏云金杆菌粉剂进行质量检验，确保符合相关标准要求。

福建农林大学学报(自然科学版)第31卷第3期Journal of Fujian A griculture and Fo restry U niversity(N atural Science Editi on)2002年9月苏云金杆菌摇瓶发酵培养基黄天培,邱思鑫,黄志鹏,黄必旺,关　雄(福建农林大学生物技术中心,福建福州350002)摘要:采用正交试验法,对苏云金芽孢杆菌高毒力菌株T S16进行了摇瓶发酵培养基筛选试验.结果表明,不同原料对发酵液毒力的影响相差很大,在几种培养基组分中以鱼粉对发酵液的影响最大.试验所得的最佳培养基组合为:黄豆饼粉32g ・L21、玉米粉14g・L21、花生饼粉32g・L21、鱼粉14g・L21、蛋白胨4g・L21、酵母6g・L21、FeSO4・7H2O0.04g・L21、Zn2 SO4・7H2O0.08g・L21.关键词:苏云金芽孢杆菌;培养基筛选;正交设计中图分类号:Q939.97文献标识码:A文章编号:100627817(2002)0320317203M ed iu m of shak i ng f la sk ferm en ta tion of B acillus thu r ing iens isHUAN G T ian2p ei,Q I U Si2x in,HUAN G Zh i2p eng,HUAN G B i2w ang,GUAN X i ong(B i o techno logy Center,Fujian A griculture and Fo restry U niversity,Fuzhou,Fujian350002,Ch ina)Abstract:T he op ti m izati on experi m ent of m edium of shak ing flask fer m entati on of B acillus thu ring iensis T S16strain w as conducted by the o rthogonal design.T he results w ere as fo llow s:the effects of agricultural by2p roducts on the fer m enta2 ti on liquids w ere different,fishm eal w as the mo st effecient substrate fo r B t;by o rthogonal design experi m ent,the best m edium fo r m ula w as go t,w h ich w as:defatted soy flour32g・L21,co rn m eal14g・L21,defatted peanut flour32g・L21, fishm eal14g・L21,pep tone4g・L21,yeasts6g・L21,FeSO4・7H2O0.04g・L21and ZnSO4・7H2O0.08g・L21.Key words:B acillus thu ring iensis;m edium op ti m izati on;o rthogonal design苏云金杆菌对营养要求不高,除了在牛肉膏蛋白胨培养基中生长良好外,在许多由农副产品组成的培养基中,甚至一些以工业废水、废渣为主的培养基中也能生长良好[1-3].但不同的苏云金芽孢杆菌菌株之间的营养需求差异很大,故不能以某一特定配方作为所有苏云金芽孢杆菌的发酵培养基.从化学成分的角度确定苏云金芽孢杆菌的培养基组分是很难的[4].不同农副产品、它们之间的不同配比以及培养基的含固量,对菌株可产生显著的毒力差异[2,5-7].因此,发酵培养基配方的筛选在B t的工业化生产上尤为重要.1　材料与方法1.1　菌株苏云金芽孢杆菌T S16菌株为福建农林大学生物技术中心选育、保存.1.2　供试昆虫参照农业部行业标准N Y293295饲养的小菜蛾(P lu tella xy lostella),采自福州建新蔬菜基地.1.3　培养基原料LB培养基(质量浓度):胰蛋白胨10g・L21(东海制药厂产品)、酵母膏5g・L21(上海生物化学试剂公司产品)、N aC l10g・L21(广东西陇化工厂产品)、pH7.2.筛选培养基:黄豆饼粉、鱼粉、花生饼粉(泰禾集团)、淀粉、玉米粉(浦城生物农药厂)、蛋白胨(东海制药厂产品)、酵母膏、FeSO4・7H2O(上海山海工学实验厂产品)、ZnSO4・7H2O(浙江杭州萧山化学试剂厂产品)、M nSO4・H2O(广州化学试剂公司产品)、M g2 SO4・7H2O(广东金山县兴塔化工厂产品).1.4　培养基筛选试验根据文献[7]中的试验方法设置适当的培养基组合,选择黄豆饼粉、玉米粉、花生饼粉、鱼粉、酵母膏、蛋白胨等6个因素,每个因素选高、中、低3个浓度进行正交试验设计[8,9].应用L18(2×37)正交表对各组分进行优化试验,考察不同培养基组分对发酵液毒力的影响.各因素水平见表1.收稿日期:2001-11-01基金项目:国家“十五”攻关项目(20012BA708B072123)、福建省科技厅资助项目(2002N004)和福建省农业科技跨越计划(07032200127).作者简介:黄天培(1979-),男.研究方向:生物农药与仿生农药学.1.5　无机盐对毒力的影响试验以L 18(2×37)正交试验确定的较佳培养基为基本培养基,分别加入不同量的FeSO 4・7H 2O 、ZnSO 4・7H 2O 、M nSO 4・H 2O 和M gSO 4・7H 2O ,考察无机盐类对发酵液毒力的影响.每种无机盐选高、中、低3个浓度,采用L 9(34)正交表进行试验设计,试验设计方案见表2.　表2　无机盐正交试验因素水平表　T able 2　O rthogonal experi m ental facto r levels fo r ino rganic saltsm g ・L 21　水平Θ(FeS O 4・7H 2O )Θ(ZnS O 4・7H 2O )Θ(M nS O 4・H 2O )Θ(M gS O 4・7H 2O )180203020024080604003204090800表1　正交试验因素水平表T able 1　O rthogonal experi m ental facto r levelsg ・L 21　水平Θ(黄豆饼粉)Θ(玉米粉)Θ(花生饼粉)Θ(鱼粉)Θ(酵母膏)Θ(蛋白胨)1301632104223214281866334122514841.6　摇瓶试验按正交试验设计,分别配制不同培养基,取每种培养基25mL ,分别装入250mL 三角瓶中培养.消毒前pH 8.5.冰箱保存的斜面菌种活化后接种到新鲜的LB 培养基中过夜,再按1%接种量转接到不同的培养基中,30℃、200r ・m in 21,摇床培养至30%芽孢脱落后终止培养,加酸调节pH 值至5.5-6.0后置于冰箱备用.将发酵液按一定比例稀释后进行生物测定,并进行统计分析.1.7　生物测定方法采用浸叶饲喂法[10],即用无菌水配制好的不同浓度B t 供试药液浸泡定量的小白菜叶片,浸泡5m in 后取出,晾干后供饥饿24h 的小菜蛾3龄幼虫取食.将小菜蛾3龄幼虫接入已装有带毒小白菜叶片的养虫瓶中,每瓶接虫20头,每处理重复3次,设空白对照.将供试昆虫置于25℃恒温饲养,测定B t 发酵液对小菜蛾48h 的致死率.判断死亡与否标准是:以毛笔轻轻触动虫体,无任何反应者为死虫,否则为活虫.当对照组死亡率低于10%时,试验有效.2　结果与分析2.1　培养基筛选试验从表3可知,各因素对杀虫效果的影响以鱼粉最大.大多数因素以中间浓度水平较佳,说明已接近最佳水平,最佳水平为A 2B 2C 1D 3E 2F 3G 1,即黄豆饼粉32g ・L 21、玉米粉14g ・L 21、花生饼粉32g ・L 21、鱼粉14g ・L 21、酵母膏6g ・L 21、蛋白胨4g ・L 21.其中花生饼粉含量还处于最大值,还需进一步试验.表3　培养基筛选正交试验结果1)T able 3　O rthogonal experi m ental results of m edium op ti m izati on试验号A B C D E F G 校正死亡率 %1111111171.22122222274.63133333372.84211223384.75222331169.56233112247.57312132345.88323213171.29331321279.710113322164.411121133247.412132211356.013212313271.214223121367.815231232181.416313231257.617321312371.218332123157.6j 386.4394.9435.6337.3388.3401.7415.3 j 422.0401.7374.7425.5428.8384.8377.9j383.1394.9381.3428.8374.5405.1398.3R j 38.96.860.991.654.320.337.4S j77.92.5186.1448.9132.819.358.1　1)A .黄豆饼粉;B .玉米粉;C .花生饼粉;D .鱼粉;E .酵母膏;F .蛋白胨;G .空列.2.2　无机盐对毒力影响的试验选择表3中4号培养基组合进行无机盐对杀虫效果影响的正交试验(表4).从表4可知,FeSO 4・7H 2O 对B t 毒力影响较明显,其次是ZnSO 4・7H 2O ,而M nSO 4・H 2O 、M gSO 4・7H 2O 的影响较小,因此・813・福建农林大学学报(自然科学版)第31卷在发酵培养基中加入0.04g ・L 21FeSO 4・7H 2O 和0.08g ・L 21ZnSO 4・7H 2O ,有助于提高发酵液毒力.　表4　无机盐对毒力影响的正交试验结果1)　T able 4　O rthogonal experi m ent of effects of m edium w ith ino rganic salts on B t　toxicity 试验号A B C D 校正死亡率 %1111178.42122281.73133375.04212391.75223190.06231281.77313283.38321385.09332178.4j 235.1254.2245.1245.2 j 261.8255.1251.8247.5j247.0235.1247.5251.7R j 26.720.06.76.5S j58.142.13.53.3 1)A :FeSO 4・7H 2O ;B :ZnSO 4・7H 2O ;C :M nSO 4・H 2O ;D :M gSO 4・7H 2O .3　结果与讨论不同苏云金杆菌菌株对矿物质的需求各不相同,不同矿物质对发酵液毒力影响不一样,且在工业培养基中矿物质的加入量还与农副产品中矿物质含量有关.因此,对培养基中矿物质含量也要进行优化.Zn 2+、M n 2+、N H 4+、K 3PO 4等能刺激外毒素的产生,其产生量受各物质浓度的影响,高盐浓度会破坏产孢和外毒素的相关性,对矿物质浓度优化后可得到高产孢和外毒素配方.在试验中没有对微量元素进行详细筛选,只对4种B t 所需常规无机盐进行了简单研究,这方面工作还有待于以后进一步加强.参考文献:[1]喻子牛.苏云金杆菌[M ].北京:科学出版社,1990.60-64.[2]M ORR IS O N ,KANA GA RA TNAM P ,CONV ER SE V .Suitability of 30agricultural p roducts and by 2p roducts as nu 2trient sources fo r labo rato ry p roducti on of B acillus thu ring iensis subsp .aiz aw ai (HD 133)[J ].Journal of I nvertebrate Pathology ,1997,70(2):113-120.[3]林剑,郑丽,郭尽力,等.苏云金杆菌在味精废水中的培养与发酵特性[J ].生物技术,1998,8(5):32-35.[4]关雄.苏云金芽孢杆菌8010的研究[M ].北京:科学出版社,1997.35.[5]ABD EL 2HAM EED A ,CA RLBER G G ,EL 2TA YEB O M ,et al.Studies on B acillus thu ring iensis H 214strains iso lated in Egyp t 2 .Selecti on of m edia fo r delta 2endo toxin p roducti on [J ].W orld Journal of M icrobiology and B iotechnology ,1990,6(3):3132317.[6]徐宏革,袁志明,蔡全信,等.苏云金杆菌Z 113菌株发酵培养基的筛选[J ].武汉大学学报,1998,44(杀虫微生物专刊):35-39.[7]操时树,鲁松清,喻子牛.苏云金芽孢杆菌工程的发酵培养基的优选[A ].喻子牛.微生物农药及其产业化[M ].北京:科学出版社,2000.98-104.[8]周润兰,喻胜华.应用生物统计[M ].北京:科学出版社,1999.182-197.[9]李春喜,王志和,王文林.生物统计学(第2版)[M ].北京:科学出版社,2000.149-156.[10]陈涛.生物农药检测及其原理[M ].北京:农业出版社,1993.167.(责任编辑:叶济蓉) ・913・第3期黄天培等:苏云金杆菌摇瓶发酵培养基。