EF—hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响
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重组人钙调蛋白磷酸酶b亚基
重组人钙调蛋白磷酸酶b亚基,也被称为重组钙调蛋白磷酸酶β亚基(Recombinant Calmodulin-dependent Protein Kinase II Beta Subunit,简称rCaMKIIβ),是一种蛋白质,在细胞中发挥着重要的调节功能。
rCaMKIIβ是一种酶,能够将ATP转化为ADP,并且通过磷酸化作用调节其他蛋白质的活性。
它是一种钙依赖性酶,需要钙离子的存在才能发挥作用。
rCaMKIIβ亚基主要参与细胞内信号传导和调节神经元的功能。
rCaMKIIβ在神经系统中发挥着非常重要的作用,特别是在学习和记忆的过程中。
研究表明,rCaMKIIβ能够促进神经元之间的突触可塑性,并且参与了长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)等神经元之间的信号传递过程。
此外,rCaMKIIβ还参与了心脏肌肉细胞的调节。
它能够磷酸化肌钙蛋白和肌球蛋白,从而调节心肌收缩和松弛的过程。
因此,rCaMKIIβ在心血管疾病的治疗中也具有潜在的作用。
目前,rCaMKIIβ已经被广泛用于生物医学研究中,包括神经科学、心血管疾病和肿瘤等领域。
通过研究rCaMKIIβ的功能和调控机制,可以深入了解细胞信号传导的过程,为疾病的治疗和预防提供更好的理论基础和实验依据。
Ca2+在信号传导中对植物生理的影响一、摘要本文简要分析Ca2+在信号传导中作为第二信使配合钙调蛋白和钙依赖型蛋白激酶的机制原理,并概述其对植物生长生理的影响。
二、关键词:Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道,矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用,Ca2+就是其中最为重要的离子之一。
Ca2+既是植物细胞壁的重要组成部分,大部分Ca2+在细胞壁中与果胶酸形成果胶酸钙,起支持和加固作用;Ca2+对维持膜结构的稳定性也有一定作用;同时,Ca2+作为第二信使配合钙调蛋白和CDPK在植物生理的信号传导过程中具有重要作用。
四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L,而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。
细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。
细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的,当受到刺激时,由于胞外Ca2+浓度高与胞内,此平衡就会被打破。
信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动,从而引起膜电位的改变。
在质膜上,存在Ca2+通道,类似于水通道,引起Ca2+的内流;同时存在Ca2+泵,是Ca2+外流的通道。
在胞内钙库如液泡、ER等结构的膜上也存在相应的结构,其上的Ca2+通道是从钙库流向胞质的通道,Ca2+泵、Ca2+/nH+反向运输体是Ca2+从胞质流向钙库的通道。
因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。
任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。
2、Ca2+的作用方式有两种:第一种是游离Ca2+的浓度直接或间接影响植物的生理过程;第二种是胞质里的Ca2+与钙结合蛋白,如钙调蛋白CaM(也叫钙调素)、钙依赖型蛋白激酶(CDPK)结合而起作用。
3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广,功能最重要的钙依赖性调节蛋白。
钙调蛋白磷酸酶
钙调蛋白磷酸酶(calcineurin)是一种重要的酶类,它在细胞内起着重要的调节作用。
钙调蛋白磷酸酶是一种钙依赖性的磷酸酶,它能够通过调节细胞内的钙离子浓度来影响细胞的生理功能。
钙调蛋白磷酸酶的结构比较复杂,它由两个亚基组成,分别是钙调蛋白磷酸酶A亚基(calcineurin A)和钙调蛋白磷酸酶B亚基(calcineurin B)。
其中,钙调蛋白磷酸酶A亚基是酶的催化亚基,而钙调蛋白磷酸酶B亚基则是酶的钙离子结合亚基。
钙调蛋白磷酸酶在细胞内的作用非常广泛,它能够调节多种细胞信号通路的活性,包括T细胞受体信号通路、NFAT信号通路、Wnt 信号通路等。
在T细胞受体信号通路中,钙调蛋白磷酸酶能够调节
T细胞的增殖和分化,从而影响免疫应答的强度和方向。
在NFAT 信号通路中,钙调蛋白磷酸酶能够调节NFAT转录因子的活性,从而影响多种细胞功能,包括心肌细胞的收缩和心血管系统的发育等。
在Wnt信号通路中,钙调蛋白磷酸酶能够调节β-catenin的稳定性,从而影响细胞的增殖和分化。
除了在正常生理过程中的作用外,钙调蛋白磷酸酶还与多种疾病的发生和发展密切相关。
例如,在心血管疾病中,钙调蛋白磷酸酶的活性异常会导致心肌细胞的收缩力下降和心血管系统的发育异常。
在神经系统疾病中,钙调蛋白磷酸酶的活性异常会导致神经元的功能异常和神经退行性疾病的发生。
钙调蛋白磷酸酶是一种非常重要的酶类,它在细胞内起着重要的调节作用。
钙调蛋白磷酸酶的异常活性与多种疾病的发生和发展密切相关,因此,对钙调蛋白磷酸酶的研究具有重要的理论和实际意义。
钙调蛋白和钙调磷酸酶
钙调蛋白(calmodulin,CaM)和钙调磷酸酶(calcineurin)是两种与钙离子调节相关的重要蛋白质,在细胞信号传导和调控中发挥着重要作用。
钙调蛋白(calmodulin,CaM):
CaM是一种高度保守的钙离子调节蛋白,在许多生物体中都广泛存在,并参与了许多细胞功能的调控。
在没有钙离子结合时,CaM呈现出一种不活跃的状态。
而当细胞内钙离子浓度增加时,CaM会与钙离子结合形成Ca2+-CaM复合物。
Ca2+-CaM复合物可以调节许多蛋白质的活性,包括激酶、磷酸酶、离子通道等。
通过与这些靶蛋白结合,Ca2+-CaM复合物可以调节它们的活性,从而影响细胞内的信号传导和生物学响应。
钙调磷酸酶(calcineurin):
calcineurin是一种钙调节的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,也被称为钙调蛋白依赖性磷酸酶。
calcineurin在细胞信号传导中起着关键的作用,特别是在T细胞和神经元中。
calcineurin的活性受到钙离子和CaM的调控。
当细胞内的钙离子浓度升高时,Ca2+-CaM复合物会激活calcineurin,使其活化。
活化的calcineurin可以去磷酸化和调节多种底物蛋白,包括核因子和细胞凋亡相关蛋白,从而影响细胞的功能和命运。
总的来说,钙调蛋白和钙调磷酸酶是细胞内钙离子信号传导中的重要组成部分,它们通过与钙离子结合和活化,调节多种蛋白质的活性,参与了细胞的生理过程和生物学响应。
1。
植物钙依赖的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)胞质Ca2+是真核生物细胞信号转导的重要第二信使。
为了维持正常的生理、生化功能,植物细胞中Ca2+的分布严格区域化,在正常生长条件下胞质中的自由Ca2+稳定在约100-200 nM 的低水平,大量的Ca2+贮存在液泡、内质网、线粒体等细胞器中,这些细胞器中Ca2+浓度通常达到µM-mM水平(Bush,1995)。
另外,胞外Ca2+浓度也显著高于胞质的浓度。
当细胞受到外界刺激后,Ca2+从胞内储藏处和胞外流向胞质,使胞质Ca2+浓度产生瞬时的变化。
Ca2+浓度的这种变化主要是通过存在于质膜及细胞内膜上的Ca2+通道与Ca2+泵及Ca2+/ H+ 反向转运子的作用来实现的(Bush, 1995; Thuleau et al., 1998; Allen et al., 2000; Hwang et al., 2000; Harper, 2001)。
胞质自由Ca2+的变化不仅仅表现在浓度绝对值的增加,而且还表现在Ca2+流的动力学方面,如浓度变化的持续时间、振幅等,所有这些变化共同产生编码特异生物信息的Ca2+信号。
大量研究表明许多外界因素均能刺激植物细胞产生Ca2+信号,这些因素包括光、非生物胁迫(如高温、干旱、低温、高盐、机械伤害等)、生物胁迫(病原菌侵染)和植物激素(如ABA等)等(Sanders et al., 1999; Evans et al., 2001; Rudd and Franklin-Tong, 2001)。
Ca2+信号经过Ca2+传感蛋白(靶蛋白)的识别、解码进入到下游的生物过程,如磷酸化级联、基因表达的调控等(Sanders et al., 1999; Rudd and Franklin-Tong, 2001)。
钙调蛋白和钙调磷酸酶全文共四篇示例,供读者参考第一篇示例:钙调蛋白和钙调磷酸酶都是与细胞内钙离子平衡调节相关的重要分子。
它们在细胞中扮演着重要的调节作用,对于维持细胞内环境的稳定和功能的正常发挥起着关键的作用。
下面就让我们来详细了解一下这两种分子的特性以及它们在生物体内的重要作用。
让我们先来了解一下钙调蛋白。
钙调蛋白是一类能够调节细胞内钙离子浓度的蛋白质,它们可以通过结合到钙离子上来转变其活性。
钙调蛋白可以通过调节细胞内钙离子平衡来影响多种重要的细胞功能,比如细胞的收缩、分裂、凋亡等。
在真核生物中,钙调蛋白种类众多,比如肌钙蛋白、调节蛋白C、调节蛋白D等。
这些钙调蛋白在不同的细胞类型中扮演着不同的角色,但它们的共同点是都能感知细胞内钙离子浓度的变化,并通过调节相应的信号通路来传递这种信号。
另外一种重要的调节细胞内钙离子平衡的分子是钙调磷酸酶。
钙调磷酸酶是一种能够调解细胞内钙离子信号的酶,它通过去磷酸化或磷酸化靶蛋白来完成对信号分子的调节作用。
钙调磷酸酶在细胞内被广泛分布,可以调节多种重要的细胞功能,比如信号传导、代谢调节、基因表达等。
在细胞内,钙调磷酸酶与钙调蛋白通常会形成一个负反馈调节回路,通过相互作用来维持细胞内钙离子的稳定水平,避免发生过高或过低的钙离子浓度。
钙调蛋白和钙调磷酸酶的相互作用在细胞内起着重要的协同作用,它们共同维持了细胞内钙离子平衡,保证了细胞功能的正常运转。
在激活信号通路、细胞增殖、细胞凋亡等过程中,钙调蛋白和钙调磷酸酶的协同作用非常重要。
通过调节这两种分子的活性,细胞可以有效地对抗外界环境的变化,保持自身的生存优势。
钙调蛋白和钙调磷酸酶在细胞内起着非常重要的调节作用,它们共同维持了细胞内钙离子平衡,保证了细胞的正常功能。
这两种分子的相互作用和调节机制为我们深入了解细胞内信号传导、代谢调节等生物学过程提供了重要的参考。
在未来的研究中,更深入地探究钙调蛋白和钙调磷酸酶的功能和调节机制,将有助于我们更好地理解细胞内的调控机制,从而为疾病的治疗和药物的研发提供新的思路和途径。
CBL家族在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用摘要钙离子作为第二信使,参与植物体中生长发育和逆境胁迫的调节。
钙调磷酸酶b类似蛋白cbls作为钙离子感受器,通过与其互作蛋白激酶作用解密钙信号。
cbls在植物逆境胁迫以及生长发育调控方面起重要作用;近年来,这方面研究工作取得了重要进展。
针对cbl家族结构特征及其在植物逆境胁迫和生长发育中的调控作用进行简要概述。
关键词 cbl;植物;逆境胁迫;响应;生长发育;作用中图分类号 q943.2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739(2013)05-0230-02在植物中,病原体的入侵、植物激素、逆境等引起细胞内的钙离子的变化,钙离子的时空变化被称作“钙信号”。
钙信号通过各种钙离子结合蛋白传递给转运蛋白、细胞结构蛋白、代谢酶、信号蛋白和转录因子等,从而产生引起植物生理变化的反应[1]。
根据结构和功能的差异,钙离子结合蛋白可以划分为钙调蛋白(cam)、钙调蛋白类似蛋白(chls)、神经钙调蛋白b(cnb)、cnb同源蛋白(chps)和神经元钙离子感受器(ncs)等。
钙离子结合蛋白又称作钙离子感受器,分为响应型和依赖性钙离子感受器。
前者既能结合ca2+,又具有激酶活性,如钙离子依赖性蛋白激酶(cdpks);而后者只能结合ca2+,并与特异的蛋白激酶互作后才能传递钙信号,如钙调磷酸酶b类似蛋白cbls[2]。
现就cbl家族的结构特征及其在植物逆境胁迫和生长发育中的调控作用进行介绍。
1 cbl家族的结构特征cbl基因最初是从拟南芥中克隆获得的。
由于cbl蛋白同酵母中的钙调磷酸酶 b(cnb)和动物里的神经细胞钙传感器(neuronal calcium sensor,ncs)有极高的同源性而被命名为钙调磷酸酶b类似蛋白[3]。
cbl与cnb、ncs的结构一样,多肽链折叠成2个球状的结构域,中间被1个短的连接区域隔断。
cbl作为钙感受器,具有典型的结合ca2+结构域,即ef手臂(ef-hand)。
钙调磷酸酶抑制剂作用机制钙调磷酸酶抑制剂是一类药物,通过干扰钙调磷酸酶的活性,从而对细胞内的生物化学过程产生影响。
钙调磷酸酶是一类酶,它参与了细胞内钙离子的调节和信号传导。
抑制钙调磷酸酶的活性可以阻断细胞内的信号传导,从而对多种生理过程产生调节作用。
钙调磷酸酶抑制剂主要通过两种机制发挥作用。
第一种机制是直接抑制钙调磷酸酶的活性。
钙调磷酸酶是一种依赖于钙离子的酶,它通过结合钙离子来催化底物的磷酸化反应。
钙调磷酸酶抑制剂可以竞争性地结合到钙调磷酸酶的活性位点上,从而阻断钙离子与酶的结合,进而抑制酶的活性。
这种机制使得钙调磷酸酶无法催化底物的磷酸化反应,从而影响细胞内的信号传导。
第二种机制是通过干扰钙调磷酸酶与底物的结合来发挥作用。
钙调磷酸酶通常与底物结合后才能催化底物的磷酸化反应。
钙调磷酸酶抑制剂可以与钙调磷酸酶结合,阻止钙调磷酸酶与底物的结合,从而抑制钙调磷酸酶的活性。
这种机制使得酶无法与底物发生有效的反应,从而影响细胞内的信号传导。
钙调磷酸酶抑制剂的作用机制可以对多种生理过程产生调节作用。
例如,钙调磷酸酶在神经传导过程中起着重要作用。
神经细胞通过钙离子的浓度变化来传递信号,而钙调磷酸酶则参与了这一过程。
抑制钙调磷酸酶的活性可以干扰神经细胞内钙离子的调节,从而影响神经传导的过程。
钙调磷酸酶抑制剂还可以对心血管系统产生影响。
心肌细胞的收缩和舒张过程受到钙离子的调控,而钙调磷酸酶则参与了这一过程。
抑制钙调磷酸酶的活性可以干扰心肌细胞的收缩和舒张,从而影响心血管系统的功能。
钙调磷酸酶抑制剂还可以对免疫系统产生影响。
免疫细胞的活化和增殖过程受到钙离子的调控,而钙调磷酸酶则参与了这一过程。
抑制钙调磷酸酶的活性可以干扰免疫细胞的活化和增殖,从而影响免疫系统的功能。
总结起来,钙调磷酸酶抑制剂通过干扰钙调磷酸酶的活性,从而对细胞内的生物化学过程产生影响。
这些药物可以通过直接抑制钙调磷酸酶的活性或干扰钙调磷酸酶与底物的结合来发挥作用。
EF—hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响作者:张洪菊李庆华王立洪蔺亚妮常国强庞天翔来源:《中国医药导报》2012年第35期[摘要]目的探讨EF-hand结构对钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物学功能的影响。
方法通过PCR扩增CHP2cDNA片段,构建带GFP标签的野生型及EF-hand突变型CHP2表达质粒;与钠氢离子交换蛋白1(NHE1)共转染PS120细胞;采用激光共聚焦显微镜、膜滤过法、免疫共沉淀等手段,明确CHP2结合Ca2+的数量、部位,以及对CHP2与NHE1结合的影响;在血清饥饿条件下,观察表达EF-hand突变的CHP2(NHE1/CHP2-EF3m/4m)对细胞生存的影响。
结果分别突变EF-hand结构EF3或EF4,CHP2结合Ca2+减少;同时突变EF3和EF4,CHP2不能结合Ca2+;免疫共沉淀实验结果显示乙二胺四乙酸(EDTA)剥夺CHP2携带的Ca2+之后,CHP2与NHE1结合的数量明显减少;不携带Ca2+的CHP2在细胞内与NHE1结合的数量也明显减少;在血清饥饿条件下,表达不携带Ca2+的CHP2的细胞存活数量减少。
结论CHP2能结合2个Ca2+,结合部位在EF3和EF4;携带Ca2+能增强CHP2与NHE1的结合能力;在血清饥饿条件下,携带Ca2+的CHP2能提升细胞抵抗死亡的能力。
[关键词]钙调磷酸酶B同源蛋白2;钠氢交换蛋白1;EF-hand;Ca2+[中图分类号]Q71 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210(2012)12(b)-0028-04钙调磷酸酶B同源蛋白(calcineurin B homologous protein,CHP)是具有多个EF-hand结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白。
目前报道该家族拥有3个成员,分别被命名为CHP1、CHP2、CHP3[1]。
其中CHP1广泛表达于各种组织,CHP3特异性表达在一些正常组织,而CHP2与这两个成员不同,它主要表达在一些肿瘤组织中[2]。
最初因发现其在肝癌组织中高表达而命名为肝细胞癌抗原520(hepatocellular carcinoma antigen520,HCA520)[3],因此被认为是一种肿瘤相关抗原。
CHP2已被证明在肿瘤细胞的增殖、转移等方面具有重要作用[4],目前的研究表明CHP2主要是通过调节钠氢离子交换蛋白1(Na+/H+exchanger1,NHE1)活性而发挥功能,通过与NHE1结合而激活NHE1,发挥其调控细胞内离子转运及细胞酸碱的功能[5-6]。
但是,CHP2作为一个Ca2+结合蛋白,EF-hand是其分子中结合Ca2+的关键序列,对CHP2发挥正常功能具有重要作用,目前国内尚缺乏EF-hand对CHP2细胞内定位、功能以及与NHE1的相互作用中的影响的报道,本研究将对这些内容进行探讨。
1材料与方法1.1实验试剂及材料45CaCl2购自美国Dupont-NEN公司。
NHE表达缺陷的PS120细胞系、CHP2和NHE1的兔抗人多克隆抗体及野生型人NHE1的真核细胞表达质粒pECE均由日本国立循环系统疾病中心研究所馈赠。
E.Coli(BL21-star)、LipofectamineTM2000Reagent kit购自美国Invitrogen公司。
DMEM培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司。
本实验中所用到的其他质粒均为本实验室保存。
1.2细胞培养PS120及相应的转染子按常规方法在(含25mmol/L NaHCO3、体积分数为10%的小牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素)DMEM培养基中培养于37℃,含5%CO2,饱和湿度的培养箱中。
1.3CHP2cDNA的克隆及其表达载体的构建提取人类血液细胞的总RNA,逆转录成cDNA,采用PCR扩增CHP2的全长cDNA序列,将其在合适的酶切位点克隆进含有绿色荧光蛋白标记基因的载体pEGFP-N1,对此重组质粒命名为CHP2-GFP。
同时采用基于PCR突变的方法,将四个EF-hand的-Z点的氨基酸替换为脂肪族的非极性氨基酸丙氨酸(Ala,A),这些突变EF-hand的重组质粒分别命名为CHP2-EF1m、CHP2-EF2m、CHP2-EF3m、CHP2-EF4m。
1.4重组质粒的转染应用LipofectamineTM2000将上述重组质粒转染PS120细胞,转染完成24h后利用G418筛选两周,采用流式细胞仪,根据GFP荧光标记分选得到含有相关重组质粒的单克隆细胞株。
1.5重组蛋白的制备将CHP2及其突变体的全长cDNA序列克隆到pET11(重组蛋白末端将带有6个组氨酸的标记)载体中,转化大肠杆菌E.Coli(BL21-star)制备重组蛋白His tagged-CHP2。
重组蛋白利用Ni+离子交换型树脂分离纯化重组蛋白。
1.6SDS-PAGE蛋白质电泳检测CHP2蛋白的表达及利用GFP荧光观察蛋白定位将分离纯化后的重组CHP2蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,利用考马斯亮蓝染色法,检测纯化的重组蛋白的分子量及其在聚丙烯酰胺凝胶上的泳动速度。
将共转染由GFP标记的CHP2或其突变体重组质粒及野生型人NHE1的真核细胞表达质粒的PS120细胞采用爬片法培养,待细胞长至合适密度后,采用4%多聚甲醛固定,制片,采用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光在细胞内的分布。
1.7Ca2+结合特征常数的测定将分离纯化得到的CHP2及其突变体的重组蛋白与不同浓度的45Ca2+在25℃共同孵育60 min。
孵育完成后将反应的溶液体系经过0.2μm的滤膜过滤,以不含重组蛋白的反应溶液体系作为阴性对照,待滤膜干燥后,采用放射性检测仪计量45Ca2+的在膜上的残留程度。
以加入反应体系的Ca2+含量为横坐标,以膜上残留的45Ca2+为纵坐标作图,制作Ca2+平衡曲线。
比较CHP2野生型及不同的突变体45Ca2+结合特征常数的异同。
1.8蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)1.8.1细胞裂解收获过表达NHE1的1×107PS120细胞,用预冷的PBS洗两次,用细胞刮刮下细胞置于1.5mL离心管里,加入1mL IP细胞裂解液,之后4000r/min离心5 min,吸取上清。
1.8.2免疫沉淀(IP)将上述的含蛋白提取物的上清液中加入30μL的Protein G agarose,同时加入4μg特异抗体(抗CHP2或NHE1),4℃轻微摇动1h,2000r/min 离心,弃上清,用预冷的IP细胞裂解液洗沉淀3次,加入2×蛋白上样缓冲液,沸水煮3 min,吸上清。
1.8.3电泳和转膜将所得到的上清上样,先用SDS-PAGE电泳,再用半干法电转移至硝酸纤维素膜。
再用另一种蛋白的抗体杂交,如果能得到特异的带,而阴性对照(IgG)没有带,证明两种蛋白相互结合。
1.8.4蛋白免疫印记(IB)分别在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h,一抗(抗NHE1或CHP2)孵育1h,二抗孵育1h,ECL化学发光法显色,每个样本至少重复3次。
1.9血清饥饿实验相同数量的共表达NHE1/野生型CHP2(NHE1/CHP2)或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞接种于培养瓶内,分别观察在有血清或无血清培养条件下细胞状态及数量变化。
1.10统计学方法采用统计软件SPSS11.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,以P2结果2.1EF-hand调节CHP2蛋白的构象经生物信息学方法分析表明CHP2蛋白结构内含有4个可能的EF-hand结构,分别命名为EF1、EF2、EF3、EF4。
本研究分别成功构建了CHP2蛋白的4个EF-hand突变体CHP2-EF1m、CHP2-EF2m、CHP2-EF3m、CHP2-EF4m,突变点位于EF-hand的-Z点(图1A)。
将大肠杆菌产物表达纯化后得到的CHP2及其突变体蛋白采用SDS-PAGE检测,发现已突变的CHP2-EF3m、CHP2-EF4m在凝胶上的电泳速度减慢,表明突变这两个EF-hand可能使CHP2蛋白构象的发生改变(图1B)。
结果提示EF-hand3和EF-hand4对维持CHP2的正常构象发挥重要的作用。
2.2CHP2结合Ca2+平衡曲线的测定使用膜截留法测定了EF-hand突变对CHP2钙结合能力的影响。
结果显示突变EF-hand3和EF-hand4中任意一个,CHP2结合钙能力下降为正常的1/2;同时突变EF-hand3和EF-hand4,CHP2不能结合Ca2+(图2)。
证实CHP2作为一个钙结合蛋白,其Ca2+离子的结合依赖于其分子结构中的EF-hand3和EF-hand4模体结构。
2.3Ca2+影响CHP2和NHE1蛋白的相互结合免疫共沉淀实验表明,在Ca2+存在的条件下,NHE1和CHP2能够得到很好的共沉淀,但当利用螯合剂EDTA剥夺细胞内的Ca2+之后,CHP2和NHE1的相互结合减少,表明CHP2结合Ca2+对其与NHE1的结合是至关重要的。
见图3。
2.4EF-hand3和EF-hand4调节CHP2在细胞膜上的定位通过激光共聚焦显微镜观察GFP标记的蛋白定位,我们可以发现在共转染NHE1的PS120细胞中野生型的CHP2蛋白主要定位在细胞膜上,而EF-hand突变的CHP2蛋白分布在细胞膜的量相对减少(图4)。
当EF-hand被突变,CHP2不能与Ca2+结合,CHP2与NHE1的结合能力减弱,观测到其在细胞膜上的定位减少。
表明EF-hand是否结合Ca2+能够影响CHP2与NHE1的结合及其在细胞膜上定位。
2.5不同培养条件共表达NHE1/CHP2或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞的生长状态观察在正常有血清培养条件下,共表达NHE1/CHP2或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞的生长状态无明显差异,但在去除血清即血清饥饿条件下,笔者发现共表达NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120细胞随着培养时间的延长,细胞的存活数量明显较共表达NHE1/野生型CHP2组减少,细胞死亡数目增多。
见图5。
3讨论Ca2+是参与人体各种生命活动与生理过程的重要离子,是细胞内功能最为广泛的第二信使[7]。
Ca2+作为生命活动中的重要调节因子,在某些细胞信号传导通路如活化T细胞核因子信号通路(nuclear factor of activated T cells,NFAT)中发挥着着重要的作用[8-9]。
CHP2作为Ca2+结合的蛋白,EF-hand及Ca2+对CHP2构象、功能和活性的影响尚缺乏报道,值得我们认真研究。