生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义：根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。
2.基本原理：透光度T=It / Io吸光度A=l g (Io/ It)朗伯-比尔(1ambert-Beer)定律 :A ＝KLc 【K 为吸光率，L 为溶液厚度（cm ），c 为溶液浓度 （mol/L ）】摩尔吸光系数ε：1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm 时，在某一特定波长下 的吸光度。
c=A/ε3.定量分析：（1）标准曲线(工作曲线)法 （2）对比法（3）计算法： c=A/ε（4）差示分析法（适用于浓度过浓或过稀） （5）多组分混合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法；可见光（400~760 nm ）&紫外光（200～400 nm ）&红外光（大于760 nm ）分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析——红外分光光度法 测定人体内的微量元素——原子吸收分光光度法二.电泳技术1.定义：带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电图1-1 光吸收示意图极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
2.基本原理：球形质点的迁移率与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。
ν=Q/6πrη3.影响电泳迁移率的因素：电场强度：电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的pH值：溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大溶液的离子强度：电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4.技术分类：自由电泳（无支持体）区带电泳（有支持体）：滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等5.电泳分析常用方法及其特点：小分子物质——滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质——凝胶电泳（1）醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，消除纸电泳中出现的“拖尾”现象②分离速度快，电泳时间短③样品用量少④经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化，有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存→特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测（胰岛素、溶菌酶、胎儿甲种球蛋白）（2）琼脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适合管状电泳→用于等电聚焦、免疫电泳、血清脂蛋白等蛋白质电泳，以及DNA、RNA、核苷酸的分析（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电渗→用于不同分子量蛋白质的电泳分离（4）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量→最常用定性分析蛋白质的电泳方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量测定（5）等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质→由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，适合研究蛋白质的微观不均一性（6）毛细管电泳①高灵敏度②高分辨率③高效快速④样品少⑤成本低→符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的分离条件三.层析技术固定相：固体物质或者是固定于固体物质上的成分；流动相：可以流动的物质，如水和各种溶媒1.原理：当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
2.技术分类：①按层析原理分类：名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂结和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离②按操作形式不同分类：名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离3.层析法的特点与应用①根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量；②析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图；③层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间；④分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快→适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析4.应用方向柱层析、薄膜层析（以硅胶/氧化铝为吸附剂）——分离非极性或极性不强的有机物离子交换层析——分子量相对较小的球状蛋白的分离纯化纸层析——氨基酸、糖类、肽类、抗生素的分离排阻层析——分离纯化、分析生物大分子尤其是蛋白质亲和层析法——适用于蛋白质的分离纯化气象层析——氨基酸、脂肪酸、单糖、双糖、固醇类物质的分离，多肽、蛋白质结构的测定四.离心技术1.定义：利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩和提纯的一项操作。
2.基本原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分离开。
颗粒在离心力场下的沉降情况都与沉降速度和沉降时间相关，沉降时间和速度取决于：(1)离心力；(2)颗粒的大小、形状和密度；(3)沉降介质的密度和粘度。
3.离心形式：(I)离心过滤：在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮液的过程为离心过滤。
(2)离心沉降(或澄清)：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降分离者为离心沉降(如用于净制含少量固体的液体时也称离心澄清)；(3)离心分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分离不同比重液体的过程为离心分离。
【离心过滤、离心沉降同属固-液分离，离心分离则属液-液分离】4.应用方向普通离心机——物质的分离&提取高速离心机——对样品中的悬浮物质进行高纯度的分离、浓缩、精制、提取，多用于血液、细胞、蛋白质、病毒、激素等的分离制备超速离心机——既可以分离细胞的亚细胞器，也可以分离生物大分子五．酶学技术1.酶活性：即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量（注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好）。
2.影响酶活性的因素：酶浓度、底物浓度、温度、PH、抑制剂、激活剂、时间3.Km值的应用①鉴定酶的种类②反映酶与底物的亲合力（Km值越大，酶与底物亲合力越小）③选择酶的最适底物④计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率⑤设计适宜的底物浓度4.V max值的应用用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数5.酶学分析在临床诊断上的应用（1）在肝脏疾病诊断中的应用（2）在急性心肌梗死诊断中的应用（3）在急性胰腺炎诊断中的应用（4）在骨骼疾病诊断中的应用（5）在肌肉疾病诊断中的应用（7）在前列腺疾病诊断中的应用（8）在肿瘤诊断中的应用生化经典验证性实验一．《胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素》1.实验原理：①白明胶（胶片上蛋白质，黑色）胰酶肽或氨基酸（无色）【以底片上白明胶的水解程度说明胰酶活性的高低】②酶的活性受到酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂、激活剂、时间等影响2.实验操作：取试管4支，标上序号→按顺序加入所需试剂→混匀、水浴（预热）→放入底片（全部浸没）→水浴（间歇摇动试管）→立即记录褪色时间(完全或部分）①酶浓度对酶活性的影响（以酶浓度作为变量）：在其他条件不变的情况下，当[S] 》[E]时,V与[E]成正比关系。
②温度对酶活性的影响（先置于温度100°、40°、0°、0°→1~3号管放回40°保温）：在其他条件不变的情况下，一定范围内增加温度，酶反应速度升高；超过一定的温度范围以后再增加温度，酶反应速度下降【最适温度不是酶的特征性常数】③pH对酶活性的影响（pH分别为5.0、7.0、10.0）：pH通过影响酶或底物的电离状态，可影响酶的催化活性。
【最适pH不是酶的特征性常数】④抑制剂对酶活性的影响（分别加入NaCl、HgCl2、空白试剂）：胰蛋白酶的抑制剂有重金属离子Hg2+，其与酶结合使酶活性降低或失活。
3.注意事项：①在研究一种因素对酶的活性的时，需要严格的控制反应中其他因素保持不变，只能改变要研究的某一种因素。
②掌握好水解程度是本实验的关键之一。
③HgCl2有毒，操作时要格外小心，严防中毒。
二．血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳1.实验原理：①以醋酸纤维素（醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点）为电泳支持物，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正极移动，移动速度与蛋白质所带电荷成正比，与颗粒大小成反比。
120V电泳45min后，用氨基黑10B染色，可将血清依次分为清蛋白（最远）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白②洗脱法定量：血清蛋白组分的相对百分数=A x÷A总×100%清蛋白：球蛋白=A清÷﹙Aα1+Aα2+Aβ+Aγ﹚2.实验操作：准备→标记（粗糙面、铅笔划线）→点样（粗糙面）→电泳（点样面向下，点样端置于负极）→染色（多条薄膜时应逐条浸入）→漂洗（注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅）→洗脱定量法定量（剪下各蛋白区带→0.02mol/L NaOH洗脱→将洗脱液用分光光度计比色）3.注意事项：①点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。
②点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。
③电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。
④应控制染色时间。
时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
三．丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用1.实验原理：①琥珀酸脱氢酶是一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
