氯化钙法制备感受态

制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。

制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。

1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。

该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。

操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。

2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。

3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。

4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。

5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。

2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。

操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。

2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。

3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。

4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。

5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。

在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。

2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。

3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。

4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。

Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。

次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。

12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。

可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。

计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。

感受态细胞的制备（氯化钙法）
（1）将-80℃保存的甘油管E. coli DH5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒放于37℃恒温培养箱中，过夜培养12-16 h；
（2）从平板上挑取单菌落接种于5 ml液体LB试管培养基中，37℃振荡培养过夜；
（3）按1%-5%的比例将种子菌液接种于100 ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6-0.9（一般按照2%的接种量培养3 h即可）后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；
（4）将菌液转入50 ml离心管中，在冰上放置10 min，于4℃低温离心机以6000 rpm/min 的速度离心10 min，收集菌体；
（5）弃上清，加入1/10体积（10 ml）预冷的感受态制备液buffer 1，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中切忌用力过大以免破坏菌体细胞，冰浴10 min；
（6）冰浴后再次于4℃低温离心机中以6000 rpm/min离心10 min，弃上清后在冰上加入2 ml 预冷的感受态制备液buffer 2重悬菌体，最后将细胞按100 ul/cell分装，取100 μl制备进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置于-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。

用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。

不及时使用的各管于-80℃保存。

注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。

新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。

注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。

原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。

在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。

被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。

实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。

实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。

大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。

菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。

由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。

此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。

常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。

目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。

用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。

因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。

甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。

贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。

甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。

在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。

复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。

氯化钙法制备JM109感受态细胞（屡试不爽，研究生亲身经历）
从超低温冰箱取甘油种，平板划线活化过夜
1. 从平板上挑取单菌落洗入3ml 的LB培养基，37度摇菌过夜
2. 按1%的量接种50ml 的LB培养基，摇菌到对数中期，2.5-3 h，此时培养基中的细菌呈云雾状，状态是最好的，或者OD值0.4-0.6
3. 将细菌分别转移到两个已灭菌的，已预冷的50 ml的圆底离心管中，冰浴10min，使菌液冷却至0℃
4. 收菌，4℃，10000rpm，10min，弃掉上清液，将离心管倒置于干净的滤纸上1min，使最后的痕量培养基流尽
5. 每50ml的初始培养物用30ml的预冷的0.1M的CaCl2溶液重悬，4℃，10000rpm，10min，弃掉上清液，将离心管倒置于干净的滤纸上1min，使最后的痕量培养基流尽
6. 每50ml的初始培养物用2ml的预冷的0.1M的CaCl2溶液重悬，记住用枪吹打的时候，动作一定要轻，因为感受态细胞是很脆弱，操作基本上都要在冰上
7. 加入等体积的预冷的30%的灭菌甘油水溶液，混匀后按100 μL/管（已预冷1.5ml的EP 管）在冰上分装，-80度保存备用。

氯化钙法制备感受态细胞原理【化学魔法，感受态细胞的秘密】哎哟喂，朋友们，咱们今天要聊的可是个高大上的科学话题——氯化钙法制备感受态细胞的原理。

这个听起来是不是有点像变魔术？没错，它就像是把普通的水变成了神奇的药水，让我们能够在实验室里轻松地培养出那种超级无敌的感受态细胞！咱们得知道什么是感受态细胞。

简单来说，就是那些经过特殊处理，能够接受外源DNA并稳定表达的细胞。

这些细胞就像是一个待命的“小精灵”，一旦有新的“任务”下达，它们就能立刻变身为执行者。

而氯化钙法，就是我们用来驯服这些小精灵的神奇魔法棒。

那么，氯化钙法是怎么做到的呢？其实，这全赖于氯化钙那神奇的“魔力”。

想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，那些原本呆若木鸡的细胞们就变得活跃起来，仿佛被施了魔法一样。

这个过程就像是在给细胞们穿上了一件隐形的斗篷，让他们能够在各种环境中自由穿梭，不受外界干扰。

接下来，咱们来聊聊氯化钙法的具体操作步骤。

你得准备好一些氯化钙溶液和感受态细胞。

然后，按照一定的比例将氯化钙溶液加入到感受态细胞的培养基中。

这时候，你只需要静静地等待，看着那些细胞们如何在氯化钙的“魔法”下翩翩起舞。

大约过了几分钟后，你就会发现，那些原本僵硬的细胞们已经变得活力四射，仿佛被注入了一股新生的力量。

当然啦，氯化钙法虽然神奇，但也不是万能的。

有时候，我们可能需要根据具体情况对氯化钙法进行调整。

比如，如果你需要培养的是一些对氯化钙敏感的细胞，那么你就得小心一些，避免过度使用氯化钙。

也要注意观察细胞的变化情况，以便及时调整实验条件。

我想说的是，氯化钙法制备感受态细胞的原理就像是一场精彩的魔术表演。

它不仅让我们能够在实验室里轻松地培养出感受态细胞，还让我们对生物学领域有了更深的了解和认识。

所以，下次当你看到有人用氯化钙法制备感受态细胞时，不妨学着用一颗好奇的心去探索这个神奇的世界吧！。

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。

如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。

试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

感受态大肠杆菌制备1.实验原理感受态：即细菌处于易于吸收外源DNA的状态。

当细菌处于0℃的0.1M CaCl2低渗溶液中时，细菌细胞会膨胀成球形。

而当转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌细胞表面时，经42℃水浴短时间热激处理，能促进菌细胞吸收DNA复合物，最终完成DNA 的转化。

2.仪器、材料与试剂2.1 仪器与设备超净工作台；低温离心机；恒温摇床；高压灭菌锅；恒温水浴锅；培养皿2.2 材料与试剂（1）细菌菌种：如DH5α等；（2）溶液：甘油；0.1 mmol/L CaCl2（灭菌）或者0.08 mmol/L MgCl2-0.02 mmol/L CaCl2（灭菌）（3）LB培养基：配制每升培养基时应在950 ml去离子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g，NaCl 10g，搅拌直至溶解，用5mol/L NaOH溶液（约0.2ml）调节pH值至7.0，再加入去离子水至总体积为1L，高温高压灭菌20min。

（4）LB琼脂培养板：先按上述配方配制液体培养基，在高温高压灭菌前每升培养基加入琼脂粉16g（即16g/L）。

3.实验步骤（1）从负80℃冰箱中拿出菌种；（2）在LB琼脂培养板中“Z字形”划线；（3）将培养皿置于37℃中过夜培养；（4）挑取大肠杆菌单菌落接种于10mL LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜（不超过16h）；（5）按1%~2%的接种量将上述菌液接种到20mL LB培养基中，37℃，250rpm 震荡3~4h（菌液OD值约为0.6）；（6）提前对超净工作台，移液枪，枪头，离心管等进行紫外灭菌处理；（7）取10mL培养物，冰浴10min，4℃，3000rpm离心10min；（8）弃上清，倒置1min，尽量将培养基流尽；（9）加5mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（或者0.08 mmol/L MgCl2-0.02 mmol/L CaCl2），轻轻悬浮细菌沉淀，冰上放置30min；（10）4℃，3000rpm离心10min；（11）弃上清，倒置1min，尽量将培养基流尽；（12）加入2mL预冷的0.1mol/L CaCl2-15%甘油溶液，轻轻悬浮细菌沉淀；（13）冰上放置5min，即为感受态细胞悬液；（14）每管50μl分装到1.5mL的离心管中，保存于负80℃冰箱中备用。

氯化钙法制备感受态细胞原理揭秘！氯化钙法如何变身“魔法棒”，让感受态细胞翩翩起舞嘿，朋友们，咱们今天来聊聊那个让人既激动又神秘的化学小把戏——氯化钙法制备感受态细胞。

这个听起来有点高科技的玩意儿，其实就藏在我们实验室里那些小小的试剂瓶和试管里，就像是魔法师手里的魔杖一样，轻轻一挥，就能把感受态细胞变成超级英雄！你得知道什么是感受态细胞。

这可是个高科技生物工程中的宝贝疙瘩，它就像是一个经过特殊训练、随时准备接受新挑战的小战士。

科学家们用它来接收外源DNA，就像超人接住飞来的球一样，神奇极了！那么，氯化钙法是怎么做到的呢？简单来说，就是利用氯化钙这种化学物质的特性。

想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，魔杖尖端冒出了一束神奇的光，那光一接触到细胞，细胞就像被施了魔法一样，开始变得活泼起来。

这就是氯化钙法的魅力所在——它能让细胞“活”起来，准备好迎接新的挑战。

不过，别以为这个过程就这么轻松哦。

科学家们可是花了不少心思和功夫，才让这根魔杖变得如此强大。

他们先是小心翼翼地调配出一种特殊的溶液，然后轻轻地将细胞放入其中。

这个过程就像是在给细胞做一场“SPA”，让它在舒适的环境中彻底放松。

接下来，科学家们会耐心等待，就像看魔术表演一样，期待着那个神奇的时刻。

当看到细胞开始活跃起来，发出微微的荧光时，他们就知道成功了！那一刻，整个实验室都仿佛被喜悦和成就感充满。

当然啦，这个过程虽然看起来简单，但背后可是隐藏着许多科学原理和技巧。

比如，如何控制氯化钙溶液的浓度、如何避免污染、如何确保整个过程的无菌等等。

这些都是科学家们需要仔细研究和掌握的知识。

我想说的是，虽然氯化钙法制备感受态细胞听起来有点神秘兮兮的，但它其实并不是遥不可及的魔法。

只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能像变魔术一样，轻松地将感受态细胞变成超级英雄！所以啊，下次当你看到实验室里的那些小小试剂瓶和试管时，不妨想想它们背后的科学原理和故事。

说不定你会发现，那些看似平凡的试剂瓶里，藏着多少令人惊叹的科学奥秘呢！。

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。

本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。

由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。

能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。

转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。

二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。

三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。

1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。

实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。

通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。

细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。

将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。

通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。

三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。

2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。

2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。

3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。

应准备两个培养物。

4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。

OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。

所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。

5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。

6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。

7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。

氯化钙法制备感受态细胞下面的方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。

该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且快速，重复性更好。

该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。

１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。

为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。

在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各浓度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。

２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。

切记：下述所有步骤均需无菌操作。

３）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。

４）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。

５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。

制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。

对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。

６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。

氯化钙法制备感受态一、我制氯化钙法感受态的步骤：二、1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm过夜培养；三、2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm培养2.5 h（OD600nm介于0.4-0.5）；四、3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；五、4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰浴30 min，4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；六、5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，滴加2滴（约100 μl）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。

七、八、需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。

氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。

九、另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受态，不贵。

十、十一、热激法转化大肠杆菌十二、1) 将质粒5 μl （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻柔旋转EP管以混合，置冰浴30 min；十三、2) 随后静置于42 ℃水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；十四、3) 加入895 μl（凑个1ml的总体积，其实多点少点没啥的）LB液体培养基，37 ℃水浴45 min（摇床也行，但是转速要在50rpm 内，太快了容易让质粒丢失）；十五、4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；十六、6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min，倾倒上清，以残留的培养基（~200 μl）混悬细菌，滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；十七、7) 待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大小。

2007-4-19 健康科学研究所 B细胞与自身抗体研究组 刘占杰CaCl2法制备感受态细胞1、划线（无选择性LB-Agar平板），37℃培养16-20h；2、挑单菌落到2ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜；；3、取1ml过夜菌液到100ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3hr，检测OD600nm about 0.44、将菌液转移到50ml BD管中，冰上放置10min；5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置1min；6、用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2,20mmol/l CaCl2）溶液30ml重悬细胞沉淀,冰上30min；7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置1min；8、用2ml预冷0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μl／管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃。

附：0.1mol/l CaCl2： 100ml(1.1g 无水CaCl2＋100mlddH2O)高压除菌；0.1mol/l CaCl2-MgCl2: 150ml(2.439g MgCl2·6H2O, 0.333g 无水CaCl2＋150mlddH2O) 高压除菌；转 化1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入1μl（50ng）待转化质粒；2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min3、加入SOC或LB培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；4、取200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养14-18h，观察菌落；质粒小抽(Beyotime)1、挑单菌落到3ml 选择性LB培养液中，37℃，225rpm，14-18h；2、收菌液到1.5ml EP管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一次，每管收集3ml菌液）3、用250ul溶液I预冷（保证P1已加RNase），Vortex重悬细胞；4、加溶液II 250ul，颠倒混匀4-6次，室温3min；5、加入350ul溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生;6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心60秒，倒弃收集管内液体；在质粒纯化柱内加入750ul溶液IV，最高速离心60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;8、将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50ul溶液V至管内柱面上(中央)，放置1min; 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。

氯化钙法（Calcium Chloride）本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106到2x 107转化克隆/微克超螺旋质粒DNA材料（MATERIALS）缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)培养基（Media）用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture）LB agar plates containing appropriate antibiotic核酸（Nucleic Acids）质粒DNA （Plasmid DNA）或经过重组的质粒（recombinant plasmid）方法1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。

把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C 下振荡培养过夜。

2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。

3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。

弃培养基，保留细胞沉淀。

5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液，并轻微打匀。

6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。

7. 弃MgCl2-CaCl2溶液，保留细胞沉淀。

8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。

冰浴放置若干小时为最好。

9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。

10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。

§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。

二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。

含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。

转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。

细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。

重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。

Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。

环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。

除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。

转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。

电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。

为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。

三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。